Name: Imagerie cellulaire vivante et suivi unicellulaire pour surveiller la dynamique clonale et les transitions de destin chez les organoïdes intestinaux humains et murines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez l'imagerie confocale en cellules vivantes et le suivi unicellulaire dans les organoïdes intestinaux humains et murins. Cette méthode permet d'observer en temps réel les décisions de destin cellulaire et la dynamique clonale à résolution individuelle.

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	<li>Barker N, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003-7.</li>
	<li>Clevers H. Shifting paradigms in tissue stem cell biology: insights from the intestine. Cell. 2026;189(3):706-24.</li>
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	<li>van der Linden FH, Okkelman IA, Ioannou M, Dmitriev RI. A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium. Nat Commun. 2021;12(1):7159.</li>
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	<li>Nguyen NTB, et al. Lactate controls cancer stemness and plasticity through epigenetic regulation. Cell Metab. 2025;37(4):903-19.e10.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um)&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>avec contrôle du climat pour la température et le CO2</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>colorant nucléaire far-red pour cellules vivantes</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>fait maison</td><td></td><td>protocole pour générer le plasmide DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>fait maison</td><td></td><td>protocole pour générer le plasmide DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR&nbsp;</td><td>fait maison</td><td></td><td>protocole pour générer le plasmide DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>colorant DNA far-red pour cellules vivantes</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitor)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;commande personnalisée</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>fait maison</td><td></td><td>La production de Wnt3A conditioned medium peut être trouvée ici:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie cellulaire vivante et suivi unicellulaire pour surveiller la dynamique clonale et les transitions de destin chez les organoïdes intestinaux humains et murines

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

Imagerie cellulaire vivante et suivi unicellulaire pour surveiller la dynamique clonale et les transitions de destin chez les organoïdes intestinaux humains et murines

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

Notre recherche se concentre sur l'étude de la manière dont les cellules individuelles prennent leurs décisions de destin et coordonnent leurs comportements au sein de l'épithélium intestinal autorégénérateur. La microscopie optique ne permet pas de distinguer un marqueur omniprésent, par exemple le compartiment membranaire d'une cellule ou le cytosquelette, et de l'attribuer précisément à une cellule donnée ou à ses voisines. Cependant, les organoïdes en mosaïque peuvent effectivement aider à surmonter cette limitation.Pour commencer, obtenez les réactifs nécessaires ainsi que les lignées validées d'organoïdes intestinaux fluorescents murins et humains. Repiquez les deux lignées d'organoïdes dans un milieu conditionné au Wnt trois jours avant la génération des organoïdes mosaiques afin de favoriser l'expansion des cellules souches et d'optimiser la viabilité cellulaire durant la dissociation. Préparez du BME à 5 % dans du DMEM. Recouvrez chaque puits d'une plaque 48-puits de 20 microlitres de BME préparé afin de former une fine couche adhésive pour l'attachement cellulaire, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, dissolvez le BME en ajoutant du milieu de base froid. Récupérez les organoïdes de chaque lignée séparément par centrifugation à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Dissociez les organoïdes en cellules individuelles en les incubant dans une solution enzymatique de détachement cellulaire pendant 5 à 7 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette P1000, pipetez répétitivement la suspension pour favoriser la dissociation mécanique. Surveillez la dissociation au microscope champ clair. Arrêtez la réaction en ajoutant un excès de milieu de base froid lorsque des cellules isolées ou de petits fragments d’organoides composés de 2 à 10 cellules sont majoritairement visibles. Ensuite, récupérez les cellules par centrifugation à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Évaluez la viabilité cellulaire et comptez les cellules viables à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan. Combinez les deux populations cellulaires au ratio souhaité afin d’obtenir un total de 300 000 cellules dans 500 microlitres de milieu conditionné au Wnt, supplémenté avec 10 micromolaire de Y-27632 dihydrochlorure pour les organoïdes mosaiques murins ou avec du milieu d’expansion humain pour les cultures d’organoïdes mosaiques humains. Mélangez soigneusement par pipetage doux. Puis, retirez le milieu de revêtement des plaques 48-puits et semez la suspension cellulaire dans les puits revêtus. Centrifugez la plaque à 200 g pendant cinq minutes à température ambiante, puis incubez à 37 degrés Celsius. Préparez une pointe de pipette P200 en la courbant. Après 24 heures, détachez mécaniquement la couche cellulaire en raclant avec la pointe de pipette courbée, puis rincez abondamment avec du milieu de base froid. Récupérez les agrégats détachés par centrifugation à 300 g pendant trois minutes à 4 degrés Celsius, sans cisaillement mécanique supplémentaire. Resuspendez les agrégats dans du BME et plantez-les dans des supports d’échantillons compatibles avec l’imagerie. Culturez les agrégats ensemencés dans du milieu ENR pour les organoïdes murins et dans du milieu d’expansion humain pour les organoïdes mosaiques humains.Utilisez des chambres d'imagerie à fond en verre pour assurer la compatibilité optique avec des objectifs confocaux à haute ouverture numérique. Déposez la suspension d'organoïdes dans la matrice extracellulaire (BME) sous forme d'une fine calotte près du centre du fond en verre. Incubez la plaque à 4 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes afin de permettre aux organoïdes de sédimenter vers le fond en verre par gravité. Transférez la plaque à 37 degrés Celsius et laissez la BME durcir pendant 20 à 30 minutes. Ajoutez 500 microlitres de milieu de croissance préchauffé dans chaque puits. Laissez les organoïdes se rétablir et établir leur morphologie pendant au moins 24 heures avant de commencer l'imagerie en temps réel. Acquérez des images en laps de temps à long terme et effectuez un suivi au niveau cellulaire unique ainsi qu'une reconstruction des lignées pour l'analyse en aval.La formation réussie de mosaïques était caractérisée soit par une distribution « sel et poivre », soit par des limites bien définies entre les deux populations, selon le degré de dissociation utilisé. Une dissociation poussée au niveau monocellulaire produisait des mosaïques de type « sel et poivre », tandis qu'une fragmentation douce préservait de petits groupements clonaux. Lorsqu'une cellule isolée, coexprimant un marqueur d'intérêt, est entourée de voisines non marquées, ses dynamiques cytosquelettiques durant la migration, la division ou l'extrusion peuvent être attribuées sans ambiguïté à cette cellule. Les marqueurs nucléaires H2B ont facilité l'identification de constellations cellulaires informatives au sein de la mosaïque, et des mesures par cellule, telles que le taux de division au cours de la durée de vie ou les dynamiques d'intensité du marqueur, ont été extraites des données de suivi. Les cellules caliciformes ont activé et maintenu une forte expression de MUC2-mNeonGreen tout au long de la période d'imagerie, tandis que les cellules de Paneth ont montré une activation initiale de MUC2-mNeonGreen suivie d'une diminution progressive du signal, puis d'une activation de DEFA5-dsRed. La quantification au niveau monocellulaire a confirmé cette transition séquentielle au niveau de cellules individuelles. Des courbes d'intensité moyenne obtenues à partir de plusieurs cellules suivies ont confirmé que ce schéma était cohérent au niveau de la population, les précurseurs des cellules de Paneth présentant une relation inverse caractéristique entre les signaux MUC2-mNeonGreen et DEFA5-dsRed.Ce protocole permet aux chercheurs d'étudier la façon dont une cellule individuelle remanie son cytosquelette, par exemple lors de la division, de la migration ou, par exemple, de l'extrusion dans un tissu intact. La prise en compte importante consiste à choisir le rapport de marquage, car des cellules rapporteuses espacées isolent les signaux au niveau de la cellule unique, tandis que des cellules non marquées espacées révèlent les réponses du voisinage. De futures études pourront combiner des rapporteurs de destin cellulaire avec un marquage en mosaïque dans un organoïde unique afin de relier les engagements de destin aux dynamiques du cytosquelette au niveau de la cellule unique.

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Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Les protocoles pour la culture de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), la transfection transitoire de marqueurs de croissance des microtubules marqués par fluorescence, l’imagerie de cellules vivantes et l’analyse automatisée de la dynamique de croissance des microtubules interphase sont détaillés.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.

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Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.

Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

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Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

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Nous présentons une méthode pour l’acquisition des cours de temps de rapporteur de fluorescence à partir de cellules simples utilisant des réseaux micropatterned. Le protocole décrit la préparation de réseaux unicellulaires, la mise en place et le fonctionnement de la microscopie time-lapse à balayage de cellules vivantes et un outil d’analyse d’image open source pour la présélection automatisée, le contrôle visuel et le suivi des cours de temps de fluorescence intégrés aux cellules par site...

Imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) - une technique polyvalente pour quantifier la cinétique cellulaire

Le présent protocole décrit une méthode de détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les organoïdes murins intestinaux à l’aide d’une imagerie qualitative et de tests de cytométrie quantitative. Ce travail peut être potentiellement étendu à d’autres sondes fluorescentes pour tester l’effet de composés sélectionnés sur les ROS.

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Découvrez l'imagerie confocale en cellules vivantes et le suivi unicellulaire dans les organoïdes intestinaux humains et murins. Cette méthode permet d'observer en temps réel les décisions de destin cellulaire et la dynamique clonale à résolution individuelle.

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