In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines

In vivo, la formation de tératomes est l’étalon-or pour déterminer la pluripotence d’une cellule ou sa capacité à former les trois couches germinales. Les tératomes sont également un obstacle majeur à la greffe de cellules souches, et on sait actuellement peu de choses sur leur formation dans la cinétique de croissance. Une fois que les cellules indifférenciées sont implantées dans l’environnement hôte, le développement du rapporteur bioluminescent, de la transduction de gènes et de la photographie CCD a permis une évaluation répétitive non invasive de la migration, de la prolifération et de la différenciation de l’emplacement cellulaire in vivo.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer un protocole détaillé pour suivre efficacement la prolifération des cellules souches embryonnaires humaines transplantées chez une souris vivante. Bonjour, je suis Kit Wilson du laboratoire de Joseph Wu dans les départements de médecine et de radiologie de l’Université de Stanford. Aujourd’hui, nous allons vous montrer les procédures d’imagerie des cellules souches embryonnaires humaines, à la fois in vitro et après transplantation chez une souris vivante.

Ces procédures comprennent les étapes suivantes : l’imagerie par bioluminescence in vitro des cellules souches embryonnaires humaines, la préparation de la souris et l’injection de cellules souches pour l’imagerie in vivo et l’imagerie par bioluminescence in vivo des cellules transplantées. Commençons donc par passer en revue certains des éléments clés de ces procédures. Afin d’effectuer l’imagerie par bioluminescence des cellules souches embryonnaires humaines, vous devez d’abord obtenir des cellules qui expriment de manière stable les gènes rapporteurs de la luciférase EL tels que la luciférase de luciférase, pilotée par un promoteur constitutif comme l’ubiquitine ou la culture alpha EEF ONE, vos cellules souches embryonnaires embryonnaires humaines positives EL Luciferase dans des conditions sans nourrisseur.

Nous suivons généralement le protocole standard des cellules Y et utilisons six plaques à puits enrobées de matrigel en utilisant soit des milieux de conditionnement, soit des milieux commerciaux sans chargeur. Pour détecter les cellules positives à la luciférase, vous aurez besoin de la sonde rapporteure d Lucifer, déjà préparée à le faire. Aliquote Lucifer dans des préparations d’un à 1,5 millilitre à une concentration finale de 45 milligrammes par millilitre.

Conservez les aliquotes à moins 20 degrés Celsius lorsqu’elles ne sont pas utilisées et évitez l’exposition à la lumière en les recouvrant d’un essuie-tout lorsqu’elles ne sont pas entreposées. Pour visualiser les cellules positives à la luciférase, nous utiliserons deux systèmes d’imagerie différents. Pour la procédure in vitro, nous utiliserons un système d’imagerie stérile, le Xeno IVUS 50, et pour l’in vivo, nous nous dirigerons vers le Stanford Center pour l’imagerie in vivo afin d’utiliser le Xeno IVUS 200.

Ce système comprend un appareil intégré et une chambre d’induction pour l’anesthésie temporaire des petits animaux. D’accord, je me suis compris. Passons à l’imagerie de bioluminescence in vitro.

Pour l’imagerie par bioluminescence in vitro, il est important de maintenir des conditions stériles. Par conséquent, le système d’imagerie doit être stérile, de préférence dans une salle de culture cellulaire. Avant l’imagerie, retirez le milieu cellulaire et ajoutez juste assez de PBS pour couvrir les cellules.

Par exemple, ajoutez un millilitre de PBS dans chaque puits d’une plaque à six puits contenant vos cultures de cellules souches embryonnaires humaines. Le rapport entre la derine et le PBS doit être de un pour 100. Ajoutez donc 10 microlitres de décongélation dans chaque puits de la plaque à six puits.

N’oubliez pas de filtrer le derin avant de l’ajouter à vos cultures. Après avoir attendu une minute, placez la plaque dans la chambre, puis prenez une image en utilisant le temps d’exposition de 10 secondes, ajustez le temps d’exposition. Si le signal est saturé ou trop faible, le signal de bioluminescence reflète le nombre de cellules, de sorte que des tests de quantification peuvent être effectués pour corréler le signal avec différents numéros de cellules.

Il s’agit d’images tirées d’un dosage de quantification typique. En haut à gauche se trouve un champ lumineux de colonies de cellules souches embryonnaires humaines. Nous savons que ces cellules portent notre gène rapporteur puisqu’elles deviennent fluorescentes en vert après coup.

Le tri de la couleur bleue est une tache de pomme. Le panneau du bas montre des puits culturels avec un nombre croissant de cellules. Le nombre de cellules est en corrélation avec le signal de bioluminescence, comme le montre ce graphique.

Cette corrélation nous donne un test semi-quantitatif pour suivre la prolifération cellulaire in vivo. D’accord, c’est la procédure in vitro. Passons maintenant à l’imagerie de bioluminescence in vivo.

Pour imager la formation du tératome in vivo, nous injecterons nos cellules souches embryonnaires humaines qui expriment le gène rapporteur de la luciférase de la luciole dans le dos d’une souris à glissement et prendrons des images bioluminescentes avec le système UVI. Lorsque vous êtes prêt à transplanter les cellules, utilisez l’espace disque ou la collagénase pour détacher les cellules, lavez-les plusieurs fois et suspendez-les dans un mélange individuel de facteur de croissance, de matrigel réduit et de dmm. En règle générale, nous mélangeons d’abord les cellules avec du DMM réfrigéré, puis nous ajoutons le matrigel.

Pour chaque site sous-cutané, nous injectons 200 000 cellules en suspension dans un volume de 50 à 100 microlitres du mélange matrigel DMM. Le numéro de cellule peut être ajusté en fonction de votre application. N’oubliez pas de tout garder sur de la glace avant l’injection.

Une fois les cellules prêtes, on anesthésie la souris en la plaçant dans la boîte d’induction. Avec le flux de fluor iso activé. Après environ une minute, la souris est anesthésiée et peut être placée sur la table d’opération avec de l’isofluor continu.

Parce que pour les fluorescents automatiques naturels et peuvent obscurcir l’image bioluminescente, nous devrons enlever les poils à l’arrière de la souris. La façon la plus simple de le faire est d’utiliser un rasoir électrique, mais vous pouvez également utiliser des gels dépilatoires, essuyer avec de l’alcool pour stériliser la peau par la suite. Ensuite, prélevez une suspension cellulaire de cent microlitres dans une seringue Les aiguilles de calibre 23 à 27 fonctionnent mieux car elles ne s’obstruent pas avec les cellules.

Maintenant, injectez les cellules sous la peau dans le dos de la souris car la peau est assez lâche. Utilisez votre pouce et votre index pour pincer et étirer la zone que vous souhaitez injecter. Injectez juste sous la peau en prenant soin de ne pas percer trop profondément.

Essayez également d’empêcher l’aiguille de glisser hors du site d’injection tout en appuyant sur le piston. Cela évitera de créer un trou dans la peau par lequel les cellules peuvent s’échapper. Si vous essayez d’injecter à nouveau après l’injection des cellules, attendez quelques heures pour permettre à la souris de se réveiller et de courir partout avant de la remettre en veille.

Pour l’imagerie par bioluminescence, cela permet d’éviter la toxicité de l’isoflurane. D’accord, nous sommes maintenant prêts à procéder à l’imagerie de bioluminescence in vivo des cellules injectées. Pour les études d’imagerie suivantes, nous utiliserons une souris qui a déjà commencé à montrer la formation d’un tératome pour l’imagerie de la bioluminescence de l’animal entier.

Nous faisons une injection intrapéritonéale de Lucifer à 375 milligrammes par kilogramme de poids corporel. Par conséquent, nous devons peser l’animal anesthésié pour calculer la dose, injecter le deed lucifer dans le péritoine, juste à côté de la ligne médiane, tirer sur l’aiguille et nous assurer qu’il n’y a pas de sang, ce qui serait une indication que vous avez endommagé un organe interne. Si la souris commence à se réveiller, remettez-la simplement dans la chambre d’induction et attendez une minute ou deux.

Préparez-vous à l’imagerie en plaçant du papier noir mat dans la boîte d’imagerie pour aider à absorber toute lumière non émise par les cellules souches embryonnaires humaines. Chez la souris, le signal de bioluminescence maximal se produit généralement 15 à 40 minutes après l’injection. Donc, après 10 à 15 minutes, placez la souris à l’envers dans la chambre d’imagerie avec de l’isofluor.

Commencez avec un temps d’exposition de 10. Si le signal est saturé, essayez de diminuer le temps d’exposition. S’il est trop faible, augmentez l’exposition.

Une fois que le temps d’exposition du signal a été optimisé pour votre souris, commencez à prendre les images toutes les minutes jusqu’à ce que le signal atteigne un maximum. La meilleure façon de le faire est d’utiliser le logiciel d’imagerie pour sélectionner les régions d’intérêt qui couvrent vos sites d’injection. En surveillant l’intensité du signal dans chaque région d’intérêt, vous pouvez facilement déterminer quand le signal commence à diminuer, indiquant que l’intensité maximale du signal a été atteinte.

Nous prenons la moyenne de trois images successives qui se produisent autour du maximum et l’utilisons comme valeur finale. Lorsque vous êtes satisfait de vos images, retirez la souris de l’isof fluorine et laissez-la se réveiller dans sa cage. Habituellement, la souris doit se réveiller dans les 15 minutes.

Après l’acquisition d’images de bioluminescence dans le temps souhaité. L’animal peut être sacrifié dans des coupes de tissus utilisées pour l’histologie. D’accord, maintenant que nous en avons tous terminé avec les procédures d’imagerie in vivo, nous pouvons examiner de plus près nos résultats et également examiner certaines études antérieures de notre laboratoire.

Voici une image de bioluminescence de trois souris atteintes de tératomes sous-cutanés. Les données du signal de bioluminescence ont été superposées sur une photo en noir et blanc des souris réalisée automatiquement pour nous par le logiciel d’imagerie. Il s’agit d’un exemple du type d’imagerie longitudinale possible avec la luciférase des lucioles.

Dans ce cas, nous avons injecté des cellules souches embryonnaires humaines directement dans le cœur après l’injection initiale. La plupart des cellules meurent au cours de la semaine suivante, comme en témoigne une diminution de la bioluminescence sur le cœur. Remarquez, la flèche noire.

Les cellules souches embryonnaires humaines qui survivent à la transplantation forment finalement un tératome dans le cœur qui peut être visualisé comme un signal augmentant rapidement à partir du 14e jour environ. Vous remarquerez qu’au septième jour, il y a une deuxième région de bioluminescence indiquée par la flèche rouge qui montre une fuite cardiaque supplémentaire de cellules souches embryonnaires humaines dans l’abdomen. C’est très courant.

Nous venons de vous montrer comment acquérir des images de bioluminescence de cellules souches embryonnaires humaines qui expriment de manière stable un gène rapporteur de la luciférase, à la fois in vitro et après transplantation sur une souris vivante. Cette méthode permet une imagerie et une surveillance répétitives de la prolifération cellulaire sans qu’il soit nécessaire de sacrifier un grand nombre d’animaux pour l’histologie, qui peut être intrinsèquement imprécise pour la quantification cellulaire. Lorsque vous effectuez cette procédure sur une souris, il est important de ne pas oublier d’utiliser la bonne concentration de delucci et d’éviter de saturer l’image de bioluminescence avec des intervalles d’exposition trop longs.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.