Name: In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-02T17:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Découvrez l'imagerie de bioluminescence in vitro et in vivo pour suivre la prolifération des cellules souches embryonnaires humaines transplantées chez la souris. Cette méthode permet une évaluation non invasive du comportement cellulaire.

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Merci à Tim Doyle, PhD, et le Centre Stanford pour l&#39;imagerie in vivo pour l&#39;aide à l&#39;imagerie par bioluminescence. Merci aussi à Ngan Huang, PhD pour le partage de sa technique sur les cellules souches co-injection avec une solution de la matrice. Enfin, grâce à Steve Felt, Ph.D. pour l&#39;aide aux soins des animaux à usage vétérinaire.

<ol><li> Construction du gène de fusion Reporter double <ol><li> Afin d&#39;effectuer l&#39;imagerie par bioluminescence de cellules souches embryonnaires humaines, vous devez d&#39;abord obtenir des cellules expriment de façon stable un gène rapporteur luciférase tels que la luciférase de luciole piloté par un promoteur constitutif, comme l&#39;ubiquitine ou EF1a. </li><li> L&#39;objectif de ce protocole est sur les applications du gène rapporteur, alors procédures détaillées ne sont pas fournies ici. Cependant, la stratégie générale de notre laboratoire est d&#39;utiliser un vecteur double fusion qui contient de construire la luciférase de luciole (fluctuations) et amélioré la protéine fluorescente verte (EGFP) séparés par une entretoise au sein pCDNA 3.1 +. </li><li> En bref, notre gène double fusion était initialement situé en aval du promoteur de cytomégalovirus dans pcDNA 3.1 (+), de sorte que le fragment de 3,3 kpb a été excisé par digestion Ndel et Notl et à bout émoussé ligaturé dans le site de clonage multiple d&#39;une auto-inactivation (NAS ) vecteur lentiviral, sous contrôle d&#39;un promoteur de l&#39;ubiquitine. </li></ol></li><li> Transduction lentiviraux <ol><li> CSEh peuvent être transduites 3-5 jours après le passage à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 10 (titre viral d&#39;environ 107 106 cellules incubées avec). </li><li> Le stock dégelé virale peut être ajouté directement aux médias CSEh frais. </li><li> Actualiser les médias 12 et 24 heures plus tard. </li><li> Après 48 h, l&#39;efficacité de transduction peut par une évaluation qualitative en utilisant la microscopie à fluorescence. Par la suite, FACS peut être utilisé pour isoler les cellules infectées. </li></ol></li><li> CSEh Culture et Introduction à l&#39;imagerie Set-up <ol><li> Culture de votre luciférase CSEh positifs dans le chargeur sans conditions. Nous généralement suivre le protocole standard WiCell et l&#39;utilisation des plaques 6 puits recouvert de facteur de croissance réduite de Matrigel, en utilisant soit des milieux conditionnés ou commerciales, chargeur-média libre. </li><li> Pour détecter les cellules luciférase positif, vous aurez besoin d&#39;avoir la sonde journaliste de D-luciférine déjà préparé. Pour ce faire partie aliquote luciférine, en 1 à 1,5 ml des préparations à une concentration finale de 45 mg / mL. Gardez les aliquotes à -20 ° C lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé et éviter l&#39;exposition à la lumière en couvrant avec un papier absorbant quand il n&#39;est pas dans le stockage. </li><li> Afin de visualiser les cellules luciférase positif, nous utilisons IVIS 50 et 200 systèmes d&#39;imagerie IVIS (Xenogen Corporation, Alameda, Californie). Ce dernier système comprend un appareil intégré et de la chambre d&#39;induction isoflourane pour l&#39;anesthésie temporaire de petits animaux. </li></ol></li><li> Dans l&#39;imagerie par bioluminescence in vitro des CSEh <ol><li> Pour l&#39;imagerie par bioluminescence in vitro, il est important de maintenir des conditions stériles. Par conséquent, le système d&#39;imagerie doivent être stériles, de préférence dans une salle de culture cellulaire. </li><li> Avant d&#39;imagerie, retirez le support de cellule et d&#39;ajouter juste assez pour couvrir PBS les cellules. Par exemple, ajouter 1 ml de PBS dans chaque puits d&#39;une plaque de 6 puits contenant vos cultures de CSEh. </li><li> Le rapport de la D-luciférine à PBS doit être 1:100, donc ajouter 10 ul de décongelés D-luciférine dans chaque puits de la plaque de 6 puits. </li><li> Attendez une minute, puis prendre une image en utilisant un temps d&#39;exposition de 1 seconde. Si le signal est faible, augmentez l&#39;intervalle d&#39;exposition et essayez à nouveau. </li><li> Le signal bioluminescent reflète le nombre de cellules, donc des tests de quantification peut être effectuée en corrélation du signal avec le nombre de cellules différentes. </li></ol></li><li> Préparation de la souris et les cellules d&#39;injection pour l&#39;imagerie in vivo <ol><li> Gène rapporteur imagerie fournit une méthode à haut débit, peu coûteuses et sensibles pour les cellules de suivi après la transplantation au fil des jours, des semaines, voire des mois. Ceci est particulièrement important car les cellules souches greffées forment fréquemment tératomes, sont rejetés par le système immunitaire de l&#39;hôte, ou tout simplement mourir. </li><li> La méthode la plus simple pour la formation de tératome imagerie in vivo consiste à injecter de CSEh qui expriment le gène rapporteur luciférase firefly dans le dos des souris SCID et d&#39;acquérir des images de bioluminescence avec le système IVIS. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à transplanter des cellules, l&#39;utilisation ou la collagénase dispase à desserrer les cellules, se laver plusieurs fois, et les suspendre dans un mélange 1:1 de facteur de croissance réduit Matrigel et DMEM. Généralement nous avons d&#39;abord mélanger les cellules avec du DMEM et refroidi, puis ajouter dans le Matrigel. Pour chaque site d&#39;injection sous-cutanée, nous injectons 200 000 cellules en suspension dans un volume de 50 à 100 ul du mélange matrigel / DMEM. Le nombre de cellules peut être ajustée en fonction de votre application. N&#39;oubliez pas de garder tout sur la glace avant l&#39;injection. </li><li> Une fois que les cellules sont prêtes, anesthésier la souris en la plaçant dans la boîte à induction à débit isoflurane allumé. Après 1-5 minutes, la souris est endormi et peut être placé sur la table d&#39;opération avec l&#39;isoflurane continu. </li><li> Parce que la fourrure naturelle d&#39;auto-fluorescence et peuvent obscurcir l&#39;image bioluminescents, nous aurons besoin pour enlever les poils de la face arrière de la souris. La meilleure façon de faire est d&#39;utiliser un rasoir électrique, mais vous pouvez également utiliser des gels d&#39;épilation. Essuyez-les avec l&#39;alcool pour stériliserla peau après </li><li> Ensuite, dessinez votre suspension cellulaire dans une seringue. 23 à 27 aiguilles de calibre meilleur travail puisqu&#39;ils ne seront pas obstruer avec des cellules. Si l&#39;aiguille est trop importante (&lt;23 gauge) le tractus aiguille peut laisser un grand trou par lequel les cellules peuvent fuir arrière. </li><li> Injecter des cellules sous la peau dans le dos de la souris. Parce que la peau est assez lâche, utiliser votre pouce et l&#39;index pour pincer et étirer la zone que vous voulez injecter. Injectez sous la peau, en prenant soin de ne pas percer trop profondément. Aussi, essayez de garder l&#39;aiguille de glisser hors du site d&#39;injection tout en appuyant sur le piston: cela empêchera la création d&#39;un trou dans la peau par lequel les cellules peuvent fuir si vous essayez d&#39;injecter à nouveau. </li><li> Après les cellules sont injectés, attendre quelques heures afin de permettre la souris pour se réveiller et courir avant de re-anesthésier d&#39;imagerie par bioluminescence. Cela évite la toxicité isoflurane. </li></ol></li><li> Dans l&#39;imagerie par bioluminescence in vivo des cellules transplantées <ol><li> Pour l&#39;imagerie par bioluminescence des animaux entiers, nous ne l&#39;injection intrapéritonéale de D-luciférine à 375 mg / kg. Peser les animaux de calculer la dose avant l&#39;injection. </li><li> Injecter le D-luciférine dans le péritoine, juste à côté de la ligne médiane. Soyez prudent de ne pas aller trop profondément ou vous pouvez endommager les organes internes. Si la souris commence à se réveiller, le replacer dans la boîte de KO et attendez une minute ou deux. Pour les souris, la bioluminescence maximale survient généralement 15-40 minutes après l&#39;injection. </li><li> N&#39;oubliez pas de placer papier mat noir dans la boîte d&#39;imagerie pour aider à absorber toute la lumière n&#39;est pas émise par les CSEh. Placez la souris (jusqu&#39;à arrière) dans la chambre de l&#39;imagerie avec l&#39;isoflurane, sur le dessus du papier noir. Commencez avec un temps d&#39;exposition de 10 secondes. Si le signal est saturé, essayez de diminuer le temps d&#39;exposition; si elle est trop faible, augmenter l&#39;exposition. </li><li> Une fois le temps d&#39;exposition du signal a été optimisé pour votre souris, commencez à prendre des images à chaque minute jusqu&#39;à ce que le signal atteigne un maximum. Le mieux est fait en utilisant le logiciel d&#39;imagerie pour sélectionner &quot;des régions d&#39;intérêt (ROI)&quot; qui couvrent vos sites d&#39;injection. En surveillant l&#39;intensité du signal à chaque ROI, vous pouvez facilement déterminer si le signal commence à diminuer, ce qui indique que l&#39;intensité du signal maximal a été atteint. Le signal maximal devrait être utilisé comme vos données finales. </li><li> Lorsque vous êtes satisfait de vos images, enlever la souris de l&#39;isoflurane et de lui permettre de se réveiller dans sa cage. Habituellement, la souris doit se réveiller dans les 15 minutes. </li><li> L&#39;imagerie par bioluminescence gène rapporteur peut être répété quotidiennement, hebdomadaire et mensuelle pour aussi longtemps que les CSEh survivre dans l&#39;animal. Signal provenant d&#39;un tératome en développement augmentera de façon exponentielle au fil du temps, typiquement de l&#39;ordre de quelques semaines, comme le CSEh commencent à proliférer. </li><li> Après le cours du temps désiré d&#39;images de bioluminescence est acquise, l&#39;animal peut être sacrifié et des coupes de tissus utilisés pour l&#39;histologie. </li></ol></li></ol>

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Comparé à d&#39;autres modalités telles que la TEP et l&#39;IRM, la bioluminescence a limité la résolution spatiale et la pénétration tissulaire réduite en raison de l&#39;énergie relativement faible de photons émis (2-3 eV); pour ces raisons, il n&#39;a jusqu&#39;ici pas été applicables dans les grands animaux. Toutefois, la bioluminescence a l&#39;avantage d&#39;être à faible coût et à haut débit, et non invasive, ce qui rend hautement souhaitable pour les cellules souches in vivo de suivi dans les petits animaux. Gènes rapporteurs non-bi...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle modifié&amp;rsquo;milieu DMEM</td><td></td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&amp;#8482; Matrice de la membrane basale</td><td>Facteur de croissance réduit (facultatif : sans rouge de phénol)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de maintien mTeSR1 pour cellules souches embryonnaires humaines</td><td></td><td>Technologies relatives aux cellules souches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciférine de luciole, sel de potassium</td><td></td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de collagénase IV</td><td></td><td></td><td></td><td>Dissoudre 30 mg de collagénase de type IV dans 30 mL de milieu DMEM-F12. Filtrer stérilement et conserver à 4 degrés Celsius.</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur cuites</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire traitées, 6 puits</td><td></td><td>Techno Plastic Products</td><td>92006</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

La découverte de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) a considérablement augmenté les outils disponibles pour les scientifiques médicaux s&#39;intéressent à la médecine régénérative. Cependant, l&#39;injection directe de CSEh, et les cellules différenciées de CSEh, dans les organismes vivants n&#39;a jusqu&#39;ici été entravée par la mort cellulaire importante, la formation de tératome, et le rejet immunitaire de l&#39;hôte. Comprendre le comportement en CSEh in vivo après transplantation nécessite des techniques d&#39;imagerie pour suivre longitudinalement la localisation de CSEh, la prolifération et la viabilité. L&#39;imagerie moléculaire a donné enquêteurs un moyen à haut débit, peu coûteux et sensibles pour le suivi de la prolifération cellulaire in vivo sur plusieurs jours, semaines, voire des mois. Ce progrès a considérablement augmenté la compréhension de la cinétique spatio-temporelle de la greffe de CSEh, la prolifération et tératome-formation chez des sujets vivants. Une avancée majeure dans l&#39;imagerie moléculaire a été l&#39;extension de la non-invasive des dosages gène rapporteur de la biologie moléculaire et cellulaire dans les plates-formes d&#39;imagerie in vivo la multi-modalité. Ces gènes rapporteurs, sous contrôle de promoteurs d&#39;ingénierie et exhausteurs qui tirent parti de la machinerie transcriptionnelle de la cellule hôte s, sont introduits dans les cellules en utilisant une variété de méthodes vectorielles et non vectorielles. Une fois dans la cellule, les gènes rapporteurs peuvent être transcrits soit de manière constitutive, ou seulement sous certaines conditions biologiques ou cellulaire, en fonction du type de promoteur utilisé. La transcription et la traduction des gènes rapporteurs dans les protéines bioactives est ensuite détecté grâce sensibles, l&#39;instrumentation non invasive (par exemple, caméras CCD) à l&#39;aide de signaux générant des sondes telles que D-luciférine. Afin d&#39;éviter le besoin de lumière excitatrice pour suivre in vivo les cellules souches est aussi nécessaire pour l&#39;imagerie de fluorescence, bioluminescence systèmes d&#39;imagerie du gène rapporteur exigent seulement une sonde exogène administrée pour induire une émission de lumière. Luciférase de luciole, dérivé de la pyralis firefly Photin, code pour une enzyme qui catalyse D-luciférine le métabolite actif optiquement, oxyluciférine. Activité optique peut alors être contrôlé avec une caméra CCD externes. Stablement transduites cellules qui transportent le journaliste de construire au sein de leur ADN chromosomique va passer le journaliste construction d&#39;ADN à des cellules filles, permettant un suivi longitudinal de la survie et la prolifération des CSEh in vivo. Par ailleurs, parce que l&#39;expression du produit du gène rapporteur est requis pour la génération du signal, seule solution viable cellules mère et fille, va créer le signal de bioluminescence; cellules apoptotiques ou morts ne sera pas. Dans cette vidéo, les matériaux spécifiques et les méthodes nécessaires pour la prolifération des cellules souches de suivi et de formation de tératome avec l&#39;imagerie par bioluminescence seront décrites.

Avec l&#39;intérêt croissant pour les thérapies de cellules souches, des techniques d&#39;imagerie moléculaire sont idéales pour le comportement des cellules souches de surveillance après la transplantation. Gènes rapporteurs luciférase ont permis non invasive, l&#39;évaluation répétitive de la survie cellulaire, l&#39;emplacement et la prolifération in vivo. Cette vidéo vous montrera comment suivre la prolifération des CSEh dans une souris vivante.

In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines

La découverte des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) a considérablement augmenté les outils disponibles pour les chercheurs en médecine s'intéressant à la régénération...

Dans un organisme vivant, la formation de tératomes constitue la norme de référence pour déterminer la pluripotence d'une cellule, c'est-à-dire sa capacité à former les trois feuillets germinatifs. Les tératomes représentent également un obstacle majeur à la transplantation de cellules souches, et actuellement, peu de choses sont connues sur leur formation en termes de cinétique de croissance. Une fois que des cellules non différenciées sont implantées dans un environnement hôte, le développement de capteurs rapporteurs bioluminescents, de la transduction génique et de la photographie ultra-sensible par dispositif à couplage de charge (CCD) a permis une évaluation non invasive et répétée de la localisation, de la migration, de la prolifération et de la différenciation cellulaires in vivo.Dans cette vidéo, nous allons démontrer un protocole détaillé permettant de suivre efficacement la prolifération de cellules souches embryonnaires humaines transplantées chez une souris vivante. Bonjour, je suis Kit Wilson du laboratoire de Joseph Wu, Départements de médecine et de radiologie à l'Université Stanford. Aujourd'hui, nous allons vous montrer les procédures d'imagerie des cellules souch

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Ici, nous décrivons les méthodes pour construire, visualiser et quantifier les réactions bioluminescentes à la fois luciole et la luciférase Renilla enzymes exprimées en cellules cancéreuses mammaires métastatiques au cours de leur croissance et les...

In vivo double Substrat Bioluminescent Imaging

Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

Nous décrivons un test de fluorescence journaliste d'identifier rapidement et de caractériser les gènes qui régulent la souris de maintenance de cellules souches embryonnaires et l'auto-renouvellement.

Essai Reporter Oct4GiP d&#39;étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Bioluminescent imagerie bactérienne<em&gt; In Vivo</em

Source : Weber, R. Z., et al., Transplantation intracérébrale et suivi de la bioluminescence in vivo des cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau de la souris. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo montre la méthode d’imagerie par bioluminescence in vivo de cellules progénitrices neurales humaines génétiquement modifiées injectées dans un cerveau de souris. Le processus implique l’injection de luciférine, la préparation de l’imagerie et la détection de signaux bioluminescents à partir...

Imagerie par bioluminescence in vivo de cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau d’une souris

Ce protocole décrit le développement, l'expansion et l'imagerie in vivo des cellules NK dérivées de CSEh et iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

Suivi en direct des progéniteurs rétiniens WT individuels dans des contextes génétiques distincts permet l'évaluation de la contribution de la signalisation non-autonome cellule pendant la neurogenèse. Ici, une combinaison de knock - down de gènes, la génération par la transplantation d' embryons chimères et in vivo d' imagerie confocale time-lapse a été utilisé à cette fin.

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d'expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l'aide d'un système d'imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.

Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Nous décrivons la transplantation intraparenchymateuse de cellules progénitrices neurales humaines transduites avec un double vecteur rapporteur exprimant la protéine fluorescente vert luciférase (GFP) dans le cerveau de la souris. Après la transplantation, le signal de la luciférase est mesuré à plusieurs reprises à l’aide de la bioluminescence in vivo et de cellules greffées exprimant la GFP identifiées dans des sections du cerveau à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Transplantation intracérébrale et suivi in vivo de la bioluminescence des cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau de la souris

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Découvrez l'imagerie de bioluminescence in vitro et in vivo pour suivre la prolifération des cellules souches embryonnaires humaines transplantées chez la souris. Cette méthode permet une évaluation non invasive du comportement cellulaire.

In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines

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