Séparation électrophorétique de protéines

La séparation des protéines individuelles à partir de mélanges protéiques complexes peut être réalisée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, également connue sous le nom de PAGE. Les protéines migrent en réponse à un champ électrique à travers les pores de la matrice du gel. La taille des pores du gel, ainsi que la charge, la taille et la forme de la protéine, déterminent la vitesse de migration de celle-ci. Dans cette vidéo, nous démontrerons une méthode de séparation électrophorétique des protéines.

Bonjour, je suis le Dr. Bobul Chakravarti du Centre de protéomique de l'Institut de post-doctorat Keck des sciences de la vie appliquées. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure pour réaliser une électrophorèse sur gel 1D. Commençons donc.

Pour commencer, assemblez le sandwich de plaques en verre de l'appareil d'électrophorèse selon les instructions du fabricant, en utilisant deux plaques en verre propres et deux entretoises de 1,5 millimètre. Fixez ensuite fermement le sandwich de plaques en verre sur le support de coulée. Préparez ensuite la solution de gel de séparation, telle que décrite dans les protocoles actuels.

Ajouter la quantité précisée de 10 % de persulfate d'ammonium et de TEMED à la solution, puis mélanger doucement. En raison de la forte concentration d'acrylamide, une dégazéification n'est pas nécessaire. À l'aide d'une pipette en plastique jetable de 10 millilitres, appliquer immédiatement la solution de gel de séparation sur le sandwich le long d'un bord de l'un des espacers, jusqu'à ce que la hauteur de la solution entre les plaques de verre soit d'environ 11 centimètres.

Ensuite, utilisez une autre pipette pour recouvrir lentement le dessus du gel d'une couche d'environ un centimètre d'épaisseur d'alcool isobutylique saturé d'eau ou d'eau distillée. Procédez en déposant délicatement l'eau le long du bord de l'un, puis de l'autre des espacers, puis laissez le gel polymériser de 30 à 60 minutes. À température ambiante, la couche d'eau assure une polymérisation du gel d'acrylamide en une ligne droite.

Une fois que le gel s'est polymérisé, nous sommes prêts à verser le gel de concentration. Versez d'abord la couche d'eau distillée, puis rincez avec un tampon tris-CL 1 x en SDS à un pH de 8,8. Préparez maintenant la solution de gel de concentration comme indiqué dans les protocoles en vigueur.

Ensuite, à l’aide d’une pipette en plastique, laissez couler lentement la solution du gel de concentration au centre du sandwich, le long du bord de l’un des espacers, jusqu’à ce que la hauteur de la solution dans le sandwich soit d’environ un centimètre du bord supérieur des plaques. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air dans le gel de concentration. Une fois le gel versé, insérez un peigne en téflon de 0,75 millimètre dans la couche de solution de gel de concentration.

Laisser polymériser la solution du gel de concentration pendant 30 à 45 minutes à température ambiante. Nous sommes maintenant prêts à préparer les échantillons de protéines. Pour commencer la préparation des échantillons de protéines, diluer une portion de l'échantillon de protéine à analyser au ratio un pour un avec un tampon d'échantillonnage SDS 2X.

Pour les solutions protéiques diluées, envisagez d'utiliser un mélange de protéine à tampon d'échantillonnage SDS à six fois dans un rapport de cinq à un. Si l'échantillon est un culot protéique précipité, dissolvez la protéine dans 50 à 100 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS 1X. Chauffez ensuite les échantillons de trois à cinq minutes à 100 degrés Celsius dans un tube microcentrifugeé à bouchon vissé hermétique, placé dans un bain-marie.

Ensuite, retirez soigneusement le peigne en téflon sans abîmer les bords des puits d'acrylamide. Après avoir retiré le peigne, rincez les puits avec du tampon d'électrophorèse SDS 1X. Puis, à l'aide d'une pipette, remplissez les puits avec du tampon d'électrophorèse SDS 1X.

Une fois les puits rincés et remplis de tampon, fixez le sandwich gélatineux à la chambre tampon supérieure. En suivant les instructions du fabricant, remplissez la chambre tampon inférieure avec la quantité recommandée de tampon d'électrophorèse XSDS 1X. Ensuite, placez le sandwich fixé à la chambre tampon supérieure dans la chambre tampon inférieure.

Remplissez maintenant complètement la chambre supérieure de tampon avec un tampon d'électrophorèse XSDS afin que les puits d'échantillons du gel de concentration soient remplis de tampon. Le gel est désormais prêt à être chargé à l’aide d’une pipette automatique de 25 ou 100 microlitres équipée de pointes pour chargement de gel : chargez l’échantillon protéique dans un ou plusieurs puits en appliquant soigneusement l’échantillon en une fine couche au fond des puits. Chargez les puits témoins avec des étalons de poids moléculaire.

Ajoutez également un volume égal de tampon d'échantillon XSDS dans les puits vides afin d'éviter la diffusion des bandes adjacentes. Nous sommes maintenant prêts à démarrer l'électrophorèse sur gel. Pour faire courir le gel, reliez l'alimentation électrique à la cuve et faites-la fonctionner à un courant constant de 30 milliampères pour un gel en plaque de 1,5 millimètre d'épaisseur.

Une fois que le colorant marqueur bleu mentholé a atteint le bas du gel de séparation, débranchez l'alimentation électrique. Maintenant que l'éléctrophorèse est terminée, jetez le tampon d'électrophorèse et retirez la chambre tampon supérieure avec le sandwich de gel fixé. Orientez le gel de manière à connaître l'ordre des puits d'échantillons.

Ensuite, retirez le sandwich de la chambre tampon supérieure et posez-le sur une feuille de papier absorbant ou des essuie-tout. Puis, faites glisser délicatement l'un des entretoises à mi-chemin depuis le bord du sandwich sur toute sa longueur. Utilisez l'entretoise exposée comme levier pour soulever délicatement la plaque de verre et ainsi découvrir soigneusement le gel.

Retirez le gel de la plaque inférieure. Coupez un petit triangle sur un coin du gel afin que l'orientation des bandes ne soit pas perdue pendant la coloration et le séchage. La procédure d'électrophorèse sur gel est maintenant terminée.

Le gel peut désormais être traité en utilisant diverses procédures de détection des protéines. Nous venons de vous montrer comment séparer les protéines par électrophorèse sur gel. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.