Coloration protéines dans les gels

Dans une vidéo précédente intitulée Séparation électrophorétique des protéines, nous avons démontré comment un mélange complexe de protéines pouvait être séparé à l’aide de l’électrophorèse sur gel. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer quatre méthodes différentes de coloration du gel pour visualiser l’emplacement des protéines dans le gel. Bonjour, je m’appelle Sean Gallagher de l’UVP et je travaille avec le Centre de protéomique de l’Institut de hautes études supérieures et du Kansas.

Aujourd’hui, je vais vous montrer un certain nombre de techniques pour visualiser les protéines après séparation par électrophorèse. Cela inclut la coloration à l’argent bleu Kamasi, l’orange cyro et le rubis cyro. Commençons donc par Kamasi blue First.

La détection de bans protéiques dans un gel par coloration au bleu de Kamasi dépend de la liaison non spécifique d’un colorant. Dans ce cas, Kamasi bleu brillant G deux 50. Dans cette méthode, les protéines séparées dans un gel de polyacrylamide sont lavées à l’aide d’eau de haute pureté.

L’emplacement des protéines est ensuite détecté à l’aide d’un colorant bleu de kamasi à base d’eau. La limite de détection est de 0,3 à un microgramme par bande de protéines. Pour commencer, commencez avec un gel de poly acrylamide dans lequel les protéines ont été séparées par électrophorèse.

Tout en agitant, placez lentement le gel de polyacrylamide dans un récipient en plastique rempli de 300 millilitres d’eau de haute pureté. Laissez agir cinq minutes. Jetez et répétez deux fois après le troisième lavage.

Versez l’eau et couvrez le gel avec la solution de coloration au bleu Kamasi pendant une heure tout en agitant lentement après une heure de coloration, versez la solution de coloration. Rincez brièvement le gel en le plaçant dans environ 200 millilitres d’eau pendant 30 minutes. À ce stade, le gel peut être stocké dans l’eau pour une imagerie future.

Le gel peut également être séché à ce stade pour maintenir un registre permanent du gel. Pour ce faire, placez le gel sur deux feuilles de papier filtre Watman de trois mm et recouvrez le dessus d’une pellicule plastique. Ensuite, séchez dans un séchoir à gel conventionnel pendant une à deux heures à environ 80 degrés Celsius.

Une autre méthode de coloration des protéines est la coloration à l’argent, que nous allons démontrer ci-dessous. Bien que la méthode de coloration au bleu de Kamasi soit plus facile et plus rapide, la coloration à l’argent est considérablement plus sensible avec une limite de détection de 0,3 nanogramme BSA. La détection de bandes protéiques dans un gel par coloration à l’argent dépend de la liaison de l’argent à divers groupes chimiques de la protéine.

Le protocole suivant est basé sur le kit de coloration à l’argent Silver Quest d’in Vitrogen. Le protocole est dérivé du protocole de coloration rapide, d’environ 30 minutes et représente l’une des nombreuses chimies basées sur des kits utilisés pour la coloration de l’argent compatible avec la spectrométrie de masse. Dans ce cas, nous utiliserons un mini gel préfabriqué in vitrogen avant de commencer la coloration à l’argent.

Assurez-vous de porter des gants en tout temps pour éviter la contamination par les empreintes digitales. Placez le gel dans un plateau allant au micro-ondes avec 100 millilitres d’eau de qualité réactif. Rincez brièvement puis versez l’eau.

Ensuite, ajoutez 100 millilitres de fixateur, composé de 40 % d’éthanol, 10 % d’acide acétique dans de l’eau de haute pureté et passez au micro-ondes pendant 30 secondes. Le processus par micro-ondes raccourcit les étapes d’incubation nécessaires en accélérant la liaison et la coloration. À ce stade, placez le gel sur un shaker et balancez-le lentement pendant cinq minutes.

Après cinq minutes, videz le fixateur, ajoutez 100 millilitres, 30 % d’éthanol pour laver le gel micro-ondes pendant 30 secondes, puis placez le gel sur un shaker pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, versez l’éthanol. Ajoutez maintenant 100 millilitres de réactif sensibilisant au micro-ondes pendant 30 secondes, puis placez-le sur un agitateur pendant deux minutes.

Après les deux minutes, videz le réactif sensibilisant. Ajoutez 100 millilitres d’eau réactive au micro-ondes pendant 30 secondes et placez-le sur un agitateur pendant deux minutes. Videz et répétez l’opération pour un total de deux cycles de lavage.

Ajoutez maintenant 100 millilitres de solution de coloration, passez au micro-ondes pendant 30 secondes et agitez lentement pendant cinq minutes. Après les cinq minutes, versez la solution de coloration. Ajoutez 100 millilitres d’eau réactive, sautez le micro-ondes, l’étape et placez directement sur un shaker pendant 20 à 60 secondes.

Jetez l’eau et ajoutez immédiatement 100 millilitres de la solution en développement et développez jusqu’à ce que les bandes de protéines deviennent visibles. Si l’arrière-plan reste clair, cela prendra environ cinq à dix minutes. À ce stade, ajoutez 10 millilitres de solution d’arrêt au révélateur pour arrêter le développement et obtenir les meilleurs résultats.

Photographiez le gel dès que possible, car il peut y avoir de légers changements dans l’intensité des couleurs et des augmentations d’éléments d’arrière-plan non spécifiques. Au fil du temps, le gel que vous voyez contient des protéines résiduelles Après l’électro-transfert, séchez le gel pour conserver un enregistrement permanent ou rangez-le dans un sac en plastique refermable. Ensuite, nous démontrons une méthode de coloration fluorescente des gels.

Les colorants fluorescents présentent un certain nombre d’avantages par rapport aux colorants protéiques traditionnels. Les colorants de gel de protéines d’orange Cipro, que nous allons décrire ici, peuvent détecter un à deux nanogrammes de protéines par bande. C’est plus sensible que la coloration bleu brillant kamasi et aussi sensible que de nombreuses techniques de coloration à l’argent.

La coloration fluorescente est simple, avec moins de temps que les protocoles de coloration à l’argent typiques, et est terminée en moins d’une heure. Les protéines colorées peuvent être visualisées à l’aide d’un transluminateur UV standard de 300 nanomètres ou d’un scanner laser. Dans ce cas, nous utiliserons à nouveau un mini-gel prémoulé in vitrogen pour commencer à préparer et à séparer les protéines à l’aide de la page SDS.

Mais utilisez 0,05 % SDS dans la mémoire tampon en cours d’exécution au lieu des 0,1 % SDS habituels afin de réduire la fluorescence de fond. Pour commencer la procédure de coloration, versez la solution de coloration fluorescente cipro orange dans un petit plat en plastique pour un ou deux mini-gels de taille standard. Utilisez environ 50 millilitres de solution de coloration.

Il est important de noter que la vaisselle qui tache doit être nettoyée et bien rincée avant utilisation, car tout détergent interférera avec la tache. Maintenant, placez le gel dans la solution de coloration. Couvrez le récipient avec du papier d’aluminium pour protéger le colorant de la lumière vive.

Agitez doucement le gel à température ambiante pendant 40 à 60 minutes. Jetez la solution de coloration, puis rincez le gel pendant moins d’une minute avec de l’acide acétique à 7,5 %, environ 100 millilitres pour enlever l’excès de tache de la surface du gel, retenez le gel en l’incubant pendant la nuit dans 0,1 % entre 20 pour visualiser et photographier les bandes de protéines. Placez le gel marqué par fluorescence directement sur un transluminateur standard de 300 nanomètres ou un transluminateur de lumière bleue.

Ensuite, nous ferons la démonstration d’une méthode alternative de coloration fluorescente, qui utilise un colorant fluorescent rubis Cipro. La méthode de coloration au rubis Cipro a été conçue spécialement pour une utilisation dans une page bidimensionnelle, mais s’est avérée être la coloration au gel protéique la plus sensible pour une page SDS unidimensionnelle standard. Pour commencer, transférez le gel dans une parabole propre en polypropylène ou en PVC de taille appropriée.

Incuber le gel dans la quantité appropriée de colorant de gel de protéine de rubis cipro non dilué avec une agitation douce et continue sur un agitateur orbital à 50 tr/min. Couvrez le gel et incubez pendant au moins trois heures. Transférez le gel dans un plat de coloration propre et lavez-le une fois dans une solution de 10 % de méthanol, 7 % d’acide acétique, récupérez et replacez le gel sur le rocker pendant 30 minutes.

Afin de réduire la fluorescence de fond et d’augmenter la sensibilité, le gel est maintenant prêt à être vu et photographié. Je tiens à vous remercier d’avoir regardé les protocoles d’aujourd’hui. Nous vous avons montré un certain nombre de procédures différentes pour visualiser les protéines après l’électrophorèse.

Certains sont très sensibles, comme la coloration fluorescente et la coloration à l’argent, et certains sont courants comme la coloration au bleu de kamasi. Il est important de se rappeler que la pureté du réactif est essentielle. L’utilisation d’eau ultra pure est également très importante, ainsi que le timing de chacune des étapes.

Vous devez y prêter une attention particulière afin d’obtenir des résultats reproductibles. C’est tout et bonne chance pour votre prochaine série d’expériences.