Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures

Bonjour, je suis Maya Sibu Bloom de l'Institut de génétique humaine et de l'Institut de cellules souches du nord-est de l'Angleterre à l'Université de Newcastle. Et voici un représentant du Collège de médecine du Wisconsin. Aujourd'hui, nous allons vous montrer notre procédure pour préparer des explants d'ovaires à partir de follicules visqueux de souris.

Les bourgeons vibrissaux sont le tissu d'origine pour la préparation de cultures de cellules souches neurales de la crête ectodermique. Cette procédure consiste à disséquer le bourrelet vibrissal, à microdisséquer les follicules pileux, puis à isoler les bourgeons ultimes de la lame (BUL) et à les placer dans une plaque de culture. Commençons donc.

Cette procédure commence par la dissection du renflement des follicules pileux des vibrisses de souris adultes. Généralement, nous utilisons des souris âgées de deux à six mois ; toutefois, les souris plus jeunes ont tendance à fournir un plus grand nombre de cellules souches. Les animaux sont anesthésiés puis complètement immergés dans un mélange équivalent de Bétadine et de peroxyde d'hydrogène pendant environ trois minutes pour désinfection, puis la souris entière, en particulier la région faciale, est aspergée d'éthanol à 75 % avant d'être transférée sous le microscope stéréoscopique.

Dans la hotte à flux laminaire, disséquer soigneusement les coussinets WHI en évitant de sectionner les bulbes pileux, puis les placer dans une solution saline tamponnée à température ambiante. Pour disséquer les follicules WHI, tenir la peau à côté du follicule avec une pince et découper tout autour du follicule à l’aide de ciseaux droits. Effectuer une incision profonde.

Pour éviter d'endommager les bulbes pileux, soulevez le follicule pileux du coussinet vibrissal et placez-le dans une nouvelle plaque. À l’aide d’HBSS frais, transférez les follicules dans la même plaque. Fixez un follicule pileux à l’aide de pinces et d’aiguilles aiguisées sur une boîte de Pétri en verre recouverte d’un tulle de soie contenant de l’HBSS.

Rincez les tissus adipeux et dermiques lâches avec des jets de tampon jusqu'à ce que le follicule pileux soit propre. Si nécessaire, sectionnez le nerf du follicule pileux et retirez les tissus adhérents par raclage et rinçages répétés avec du HBSS. Incisez longitudinalement le follicule visco avec une microlame.

Évitez de couper trop profondément, car cela blesserait la saillie. Éliminez tout sang par des rinçages répétés avec du HBSS jusqu'à disparition complète. La présence de sang constitue un bon indicateur que l'incision était suffisamment profonde.

Ensuite, effectuez une incision transversale au-dessus du niveau du sinus conique, puis une deuxième incision transversale au niveau du sinus annulaire, très près de la peau, dans le fragment de follicule isolé. Vous verrez alors la saillie située à l'intérieur de la capsule. Regardez, elle est là.

Saisissez une extrémité de la capsule avec la pince et retirez la saillie. Vous verrez alors la capsule vide et le réservoir de saillies isolées. Placez les saillies isolées dans une plaque de culture séparée contenant du HBSS à température ambiante.

Vérifiez qu'aucun autre tissu n'entache les bourgeons regroupés. À ce stade, les bourgeons peuvent être mis en culture avant la culture dans les plantes bulbeuses. Les plaques de culture de 35 millimètres sont recouvertes de collagène en déposant des gouttes de 50 microlitres de collagène et de 10 microlitres stériles.

6 % saline l'une à côté de l'autre. Bien mélanger à l'aide d'une pipette à double courbure et pousser vers le bord de la plaque de culture. Incuber toute la nuit dans un environnement propre sans laisser sécher. Nous utilisons un dessiccateur muni d'une plaque d'eau au fond à cet effet.

Le lendemain, jour de la culture. Rincer les plaques avec du sérum physiologique, pré-incuber les plaques de culture recouvertes de collagène et rincées pendant environ trois heures avec le milieu de culture. Le milieu de culture est composé de 85 % de MEM alpha modifié, de 10 % de sérum de veau fœtal et de 5 % d'extrait d'embryon de poulet du jour 11.

Après la pré-incubation, retirez le milieu de culture des plaques et ajoutez plusieurs BUL en utilisant le moins de milieu possible. Éliminez l'excès de milieu de culture. Incubez pendant une heure dans une étuve à cellules, sous une atmosphère humidifiée contenant 10 % d'oxygène et 5 % de CO2.

Après une heure, ajoutez lentement 1,5 millilitre de culture. Les plantes de taille moyenne doivent adhérer au substrat de collagène ; remplacez 50 % du milieu de culture quotidiennement. Très bien, commençons maintenant.

Et maintenant, examinons les cultures. En trois à quatre jours, des cellules hautement migratrices émigreront des greffons sphériques. Remarquez leur morphologie étoilée et l'absence prédominante de contacts entre cellules.

Au cours des prochains jours, davantage de cellules migrent et les cellules déjà migrées se multiplient rapidement, notamment de rares cellules à morphologie aplatie, dont l'apparition peut parfois être observée plusieurs jours après celle des cellules souches de la crête neuro-ectodermique épidermique. Des cellules souches sont parfois visibles dans ces cultures. Ces cellules ne sont pas des cellules souches de la crête neuro-ectodermique épidermique, mais plutôt des cellules souches ou des progéniteurs épidermiques putatifs, moins mobiles ; les cultures composées de ces cellules doivent être éliminées.

Nous venons de vous montrer comment préparer des cultures d'explant de bulbe contenant des cellules souches neurales épidermiques. Étant donné que les cellules neurales sont très migratrices, elles quittent l'explant de bulbe en trois à quatre jours. Après l'explication, la saillie est ensuite retirée et la population pure de cellules neurales reste dans la plaque de culture.

Lors de cette procédure, il est important de bien désinfecter la souris afin d'éviter toute contamination. Il faut également inciser profondément dans le bourrelet du coussinet pour ne pas endommager les follicules pileux. En ce qui concerne les cultures, il est essentiel de distinguer les cellules de la crête neurale migratrices, en distillat, des kératinocytes non migrateurs de forme pavimentaire.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.