Name: Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-09T01:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Découvrez la culture de cellules souches de la crête neurale épidermique (EPI-NCSC) chez la souris. Cette méthode permet d'isoler ces cellules à partir des follicules de vibrisses pour étudier leur migration et leurs propriétés.

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Soutenu par: USPHS octroi NS38500, Institut national des troubles neurologiques et des maladies, NIH, USA; Alliance technologie biomédicale du sud-est du Wisconsin, Milwauke, WI, USA; Bryon Paralysie Riesch Fondation, Milwaukee, WI, USA; Ordre Fraternel des Aigles, Midwest chapitre , USA, National Association lésions médullaires, Milwaukee chapitre, USA; North East England Stem Cell Institute, Université de Newcastle, Royaume-Uni.

Dissection des Ardennes de follicules adultes Whisker souris <ol><li> Nous utilisons 10 semaines à 6 mois des souris âgées. Les jeunes souris produisent souvent plusieurs cellules. Euthanasier les animaux de la souris et plongez dans l&#39;ensemble du mélange 1:1 bétadine (solution d&#39;iode) et du peroxyde d&#39;hydrogène (disponible à la pharmacie) pendant environ 3 minutes. </li><li> Squirt souris entier, en particulier la région du visage, avec de l&#39;éthanol 75%, et de la souris pour effectuer microscope à dissection dans une hotte à flux laminaire. </li><li> Disséquer babines, en évitant soigneusement de couper en bulbes pileux, et piscine dans HBSS. </li><li> Disséquer follicules moustaches et une piscine dans HBSS à température ambiante. Pour ce faire, en tenant la peau à côté de follicule pileux avec une pince, puis découpe autour du follicule avec les ciseaux droits. Couper en profondeur pour éviter de blesser les bulbes pileux. </li><li> Ascenseur follicule moustaches de pad moustaches et mis en nouvelle plaque avec HBSS frais. </li><li> Rincer adipeux lâche et de tissu cutané avec jets de tampon, jusqu&#39;à ce que les follicules moustaches sont propres. Si nécessaire, couper nerf follicule moustaches et éliminer les tissus adhérentes par grattage et bouffées répétées de HBSS. </li><li> Pin follilce cheveux propres sur Sylgard verre enduit boîte de Petri en utilisant des aiguilles de tungstène affûté, en utilisant microforceps pour la tenue de la peau sur la partie à côté du follicule. </li><li> Moustaches coupées follicule longitudically avec un microlames. Évitez de couper trop profondément, car cela va blesser le bulbe. Retirer le sang gicle avec répétées de HBSS jusqu&#39;à allé. Apparition de sang est une bonne indication que la coupe était assez profonde. Si la coupe longitudial n&#39;est pas suffisamment longue, il peut être rallongé avec microciseaux plié. </li><li> Faites une coupe transversale au-dessus du niveau du sinus caverneux et ensuite une deuxième coupe transversale au niveau des sinus dans le ring, près de la peau. </li><li> Vous allez maintenant voir le renflement intérieur de la capsule. </li><li> Prenez une fin de capsule de collagène d&#39;avec la pince et le déploiement du bulbe avec une aiguille de tungstène plié. Vous allez maintenant voir la capsule vide et le renflement isolés. </li><li> Piscine isolés renflements dans une plaque de culture séparés dans HBSS à température ambiante. Assurez-vous qu&#39;aucun autre tissu contamine les renflements en commun. </li></ol> Culture d&#39;explants bulbe <ol><li> Manteau 35 mm des plaques de culture avec du collagène en plaçant 50 collagène ul et 10 ul stérile 6% de NaCl côté de l&#39;autre. Mélangez bien avec une pipette à double plié Pasteyr et pousser vers le bord de la plaque de culture. Incuber une nuit dans un dessiccateur propre, mais ne laissez pas sécher. Avant utilisation, rincer les plaques avec une solution saline. </li><li> Pré-incuber des plaques de culture revêtus de collagène et rincés pendant environ 3 heures avec un milieu de culture. Le milieu de culture est constitué de 85% d&#39;alpha-MEM modifiés, 10% de sérum de veau fœtal et 5% jour 11 d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet. </li><li> Après ré-incubation, éliminer le milieu de culture à partir de plaques et d&#39;ajouter plusieurs renflements moyenne aussi peu que possible. Retirer l&#39;excès milieu de culture. </li><li> Incuber pendant 1 heure, mais pas plus, dans la cellule incubateur dans une atmosphère humidifiée avec de l&#39;oxygène 10% et 5% de CO 2. </li><li> Après 1 heure, doucement ajoutez 1,5 ml de milieu de culture. Explants Ardennes devraient adhérer au substrat de collagène. Remplacer 50% du milieu de culture quotidienne. </li><li> Dans les 3 - 4 jours, les cellules hautement migratoires vont émigrer de l&#39;explants renflement. Notez leur morphologie stellaire, la motilité, et l&#39;absence prédominante de contacts cellule-cellule. Au cours des prochains jours, plus de cellules d&#39;émigrer, et a émigré cellules vont proliférer rapidement. </li><li> Retirer renflement 2 - 3 jours après l&#39;apparition des EPI-NCSC l&#39;émigration avec une aiguille de tungstène affûté. Si les renflements sont laissés plus longtemps, ils ont tendance à s&#39;aplatir et à rendre impossible à obtenir purs EPI-NCSC cultures. </li><li> Important: rares cellules avec une morphologie aplatie, qui deviennent parfois apparente plusieurs jours plus tard EPI-NCSC, et qui sont moins mobiles ne sont PAS EPI-NCSC, mais putatifs cellules souches épidermiques / progéniteurs. Cultures composée de ces cellules, ou des cultures mixtes contenant du PEV-NCSC et putatifs cellules souches épidermiques / progéniteurs doivent être jetés. </li><li> Astuce: Ne pas garder les cellules pendant trop longtemps dans le milieu de explant primaire, car elles tendent à se différencier rapidement à haute densité cellulaire, en raison de putativement autocrine / paracrine de signalisation du facteur de croissance. </li></ol>

<ol><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., YF, H. u, Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Grim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+hair+follicle+-+cradle+for+pluripotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+%28Part+C%29%22%5BJournal%5D)">The adult hair follicle - cradle for pluripotent neural crest stem cells.</a> Birth Defects Research (Part C). Tuan, R., Grim, M. 72, 162-172 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Schnell, L., Grim, M., Schneider, R., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+grafts+in+the+lesioned+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Pub%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) grafts in the lesioned spinal cord.</a> Pub. 32, 67-81 (2006).</li>
<li>Hu, Y. F., Zhang, Z. -J., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) molecular signature.</a> Stem Cells. 24, Epub ahead of print 2692-2702 (2006).</li>
</ol>

En vertu de leur capacité migratoire, EPI-NCSC peut être isolé comme une population très pure de cellules souches, qui peuvent être développées in vitro. Comme vestiges embryonnaires dans un endroit adulte, EPI-NCSC sont des candidats potentiellement intéressants pour l&#39;avenir de thérapies de remplacement cellulaire, le génie biomédical et / ou la médecine régénérative. Nous avons testé le PEV-NCSC dans un modèle murin de lésion de la moelle épinière, où elles présentent des traits désirables. Grâce profilage de l&#39;expression génique...

souris épidermique neural stem cell crest (epi-ncsc) cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC sont des vestiges de la crête neurale embryonnaire dans un endroit adulte, le renflement des follicules pileux. Ce sont des cellules souches multipotentes qui ont la propriété physiologique de générer un large éventail de types de cellules différenciées, y compris les neurones, les cellules nerveuses de soutien, les cellules musculaires lisses, les os / les cellules du cartilage et des mélanocytes. EPI-NCSC sont facilement accessibles dans la peau velue et peut être isolé comme une population très pures de cellules souches. Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour la préparation de la souris EPI-NCSC cultures de follicules moustaches. Le pad moustaches d&#39;une souris adulte est enlevée, et les follicules moustaches disséqués. Les follicules sont ensuite coupées longitudinalement et transversalement par la suite au-dessus et en dessous de la région de renflement. Le renflement est retiré de la capsule de collagène et placé dans une plaque de culture. EPI-NCSC commencent à émigrer de l&#39;explants renflement 3 à 4 jours plus tard.

Ici, nous montrons notre méthode pour isoler la souris épiderme des cellules souches neurales de crête (EPI-NCSC). Technique consiste à micro-dissection follicules moustaches, isoler le renflement et il placeing en culture de tissus. EPI-NCSC commencent à émigrer à partir d&#39;explants renflement sur le substrat dans les 3 - 4 jours.

Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures

Les EPI-NCSC sont des vestiges de la crête neurale embryonnaire situés dans une zone adulte, le renflement (bulge) des follicules pileux. Ce sont des cellules souches multipotentes qui possèdent...

Bonjour, je suis Maya Sibu Bloom de l'Institut de génétique humaine et de l'Institut de cellules souches du nord-est de l'Angleterre à l'Université de Newcastle. Et voici un représentant du Collège de médecine du Wisconsin. Aujourd'hui, nous allons vous montrer notre procédure pour préparer des explants d'ovaires à partir de follicules visqueux de souris.Les bourgeons vibrissaux sont le tissu d'origine pour la préparation de cultures de cellules souches neurales de la crête ectodermique. Cette procédure consiste à disséquer le bourrelet vibrissal, à microdisséquer les follicules pileux, puis à isoler les bourgeons ultimes de la lame (BUL) et à les placer dans une plaque de culture. Commençons donc.Cette procédure commence par la dissection du renflement des follicules pileux des vibrisses de souris adultes. Généralement, nous utilisons des souris âgées de deux à six mois ; toutefois, les souris plus jeunes ont tendance à fournir un plus grand nombre de cellules souches. Les animaux sont anesthésiés puis complètement immergés dans un mélange équivalent de Bétadine et de peroxyde d'hydrogène pendant environ trois minutes pour désinfection, puis la souris entière, en particulier la région faciale, est aspergée d'éthanol à 75 % avant d'être transférée sous le microscope stéréoscopique.Dans la hotte à flux laminaire, disséquer soigneusement les coussinets WHI en évitant de sectionner les bulbes pileux, puis les placer dans une solution saline tamponnée à température ambiante. Pour disséquer les follicules WHI, tenir la peau à côté du follicule avec une pince et découper tout autour du follicule à l’aide de ciseaux droits. Effectuer une incision profonde.Pour éviter d'endommager les bulbes pileux, soulevez le follicule pileux du coussinet vibrissal et placez-le dans une nouvelle plaque. À l’aide d’HBSS frais, transférez les follicules dans la même plaque. Fixez un follicule pileux à l’aide de pinces et d’aiguilles aiguisées sur une boîte de Pétri en verre recouverte d’un tulle de soie contenant de l’HBSS.Rincez les tissus adipeux et dermiques lâches avec des jets de tampon jusqu'à ce que le follicule pileux soit propre. Si nécessaire, sectionnez le nerf du follicule pileux et retirez les tissus adhérents par raclage et rinçages répétés avec du HBSS. Incisez longitudinalement le follicule visco avec une microlame.Évitez de couper trop profondément, car cela blesserait la saillie. Éliminez tout sang par des rinçages répétés avec du HBSS jusqu'à disparition complète. La présence de sang constitue un bon indicateur que l'incision était suffisamment profonde.Ensuite, effectuez une incision transversale au-dessus du niveau du sinus conique, puis une deuxième incision transversale au niveau du sinus annulaire, très près de la peau, dans le fragment de follicule isolé. Vous verrez alors la saillie située à l'intérieur de la capsule. Regardez, elle est là.Saisissez une extrémité de la capsule avec la pince et retirez la saillie. Vous verrez alors la capsule vide et le réservoir de saillies isolées. Placez les saillies isolées dans une plaque de culture séparée contenant du HBSS à température ambiante.Vérifiez qu'aucun autre tissu n'entache les bourgeons regroupés. À ce stade, les bourgeons peuvent être mis en culture avant la culture dans les plantes bulbeuses. Les plaques de culture de 35 millimètres sont recouvertes de collagène en déposant des gouttes de 50 microlitres de collagène et de 10 microlitres stériles.6 % saline l'une à côté de l'autre. Bien mélanger à l'aide d'une pipette à double courbure et pousser vers le bord de la plaque de culture. Incuber toute la nuit dans un environnement propre sans laisser sécher. Nous utilisons un dessiccateur muni d'une plaque d'eau au fond à cet effet.Le lendemain, jour de la culture. Rincer les plaques avec du sérum physiologique, pré-incuber les plaques de culture recouvertes de collagène et rincées pendant environ trois heures avec le milieu de culture. Le milieu de culture est composé de 85 % de MEM alpha modifié, de 10 % de sérum de veau fœtal et de 5 % d'extrait d'embryon de poulet du jour 11.Après la pré-incubation, retirez le milieu de culture des plaques et ajoutez plusieurs BUL en utilisant le moins de milieu possible. Éliminez l'excès de milieu de culture. Incubez pendant une heure dans une étuve à cellules, sous une atmosphère humidifiée contenant 10 % d'oxygène et 5 % de CO2.Après une heure, ajoutez lentement 1,5 millilitre de culture. Les plantes de taille moyenne doivent adhérer au substrat de collagène ; remplacez 50 % du milieu de culture quotidiennement. Très bien, commençons maintenant.Et maintenant, examinons les cultures. En trois à quatre jours, des cellules hautement migratrices émigreront des greffons sphériques. Remarquez leur morphologie étoilée et l'absence prédominante de contacts entre cellules.Au cours des prochains jours, davantage de cellules migrent et les cellules déjà migrées se multiplient rapidement, notamment de rares cellules à morphologie aplatie, dont l'apparition peut parfois être observée plusieurs jours après celle des cellules souches de la crête neuro-ectodermique épidermique. Des cellules souches sont parfois visibles dans ces cultures. Ces cellules ne sont pas des cellules souches de la crête neuro-ectodermique épidermique, mais plutôt des cellules souches ou des progéniteurs épidermiques putatifs, moins mobiles ; les cultures composées de ces cellules doivent être éliminées.Nous venons de vous montrer comment préparer des cultures d'explant de bulbe contenant des cellules souches neurales épidermiques. Étant donné que les cellules neurales sont très migratrices, elles quittent l'explant de bulbe en trois à quatre jours. Après l'explication, la saillie est ensuite retirée et la population pure de cellules neurales reste dans la plaque de culture.Lors de cette procédure, il est important de bien désinfecter la souris afin d'éviter toute contamination. Il faut également inciser profondément dans le bourrelet du coussinet pour ne pas endommager les follicules pileux. En ce qui concerne les cultures, il est essentiel de distinguer les cellules de la crête neurale migratrices, en distillat, des kératinocytes non migrateurs de forme pavimentaire.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Culture de la souris de neurones précurseurs de cellules souches

Pour cultiver des cellules souches neurales de crête (NCSC) in vitro, un milieu spécial (NCSCM) est nécessaire. Partie essentielle de NCSCM est extrait d'embryon de poulet (PECO). Nous décrivons ici les techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO, y compris des détails comme l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration.

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Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

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Crête neurale (NC) des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation du développement humain et de la maladie et des thérapies de remplacement cellulaire. Ici, une adaptation libre-alimentation de l'a largement...

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La transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) permet aux cancers de devenir invasifs. Pour étudier l’EMT, un modèle in vitro basé sur des cellules souches neurales (NSC) dépourvu de sérum et d’enzymes est décrit. Ce système standardisé permet une évaluation quantitative et qualitative de la migration cellulaire, de l’expression des gènes et des protéines. Le modèle est adapté à la découverte de médicaments.

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