Molecular Evolution de la recombinase Tre

Je m'appelle Frank Alz. Je suis chef de groupe à l'Institut Maxx Plunk de biologie cellulaire et de génétique du macula à Dresde. Et je vais vous parler maintenant de nos travaux visant à développer des recombinases spécifiques de site pour la chirurgie moléculaire.

Fondamentalement, comme un outil permettant d'exciser des séquences prédéfinies du génome, et plus particulièrement d'éliminer les cellules infectées par le VIH en supprimant le virus. Autrement dit, exciser le provirus du VIH du génome des cellules infectées. Un autre concept consiste à adapter un outil génétique déjà bien établi, à savoir la recombinase Cre, afin de la faire lier, reconnaître et utiliser un site cible que nous prédéfinissons.

Nous avons donc cherché à déterminer s'il était possible de concevoir une recombinase spécifique d'un site qui se produit naturellement dans la région LTR d'un virus du VIH. Et si nous parvenions à réaliser cela, nous prédirions qu'il devrait alors être possible d'exciser le provirus du génome. Fondamentalement, le cycle viral comprend une étape au cours de laquelle le virus s'intègre dans les cellules, puis, par transcription inverse, forme un brin d'ADN qui est encadré par deux répétitions terminales.

On les appelle répétitions terminales longues ou courtes LTR. Celles-ci sont ensuite introduites dans le noyau et s'intègrent plus ou moins aléatoirement dans le génome de l'hôte. On se retrouve alors dans une situation où l'on a un provirus dit intégré, qui est encadré par deux répétitions terminales longues, c'est-à-dire par deux LTR.

Le concept était désormais que si nous parvenions à créer une recombinase reconnaissant une séquence présente dans le LT R, nous devrions être capables d'exciser le provirus sous forme circulaire du génome de l'hôte et, par conséquent, d'éliminer le virus des cellules. Telle était l'idée conceptuelle. Or, la recombinase est en réalité une protéine liant l'ADN qui reconnaît un site très spécifique.

Il possède donc un domaine de liaison à l'ADN, qui reconnaît une séquence spécifique au sein de l'ADN. Et seulement lorsqu'il trouve cette séquence exacte, l'enzyme est active. Elle n'est pas active sur aucune des autres séquences.

Les principes de l'évolution moléculaire sont fondamentalement connus de tous, car il ne s'agit de rien d'autre que de sélection. Ainsi, un principe de l'évolution moléculaire consiste à introduire des mutations, puis à appliquer un processus de sélection afin de retenir une propriété particulière. C'est exactement ce que l'on fait en sélection végétale.

Vous savez que vous désirez certaines caractéristiques, une taille ou une couleur précise, et vous sélectionnez alors systématiquement, pour la génération suivante, la descendance présentant ces caractéristiques particulières, puis vous commencez à les croiser entre eux. C'est exactement ce que nous faisons avec les molécules. C'est donc fondamentalement la même chose, mais à une échelle réduite.

Nous partons donc d'une enzyme possédant une activité particulière, dans notre cas la recombinase CRE, ainsi que d'une protéine de type sauvage. Nous mutons ensuite légèrement le site auquel cette recombinase se lie, site qui conserve toutefois une activité extrêmement, extrêmement faible. Puis nous introduisons des mutations aléatoires dans l'enzyme, c'est-à-dire dans la recombinase, et nous sélectionnons les mutants capables désormais de se lier à ce site muté.

Une fois que nous avons cela, nous pouvons ensuite combiner les différents mutants entre eux pour finalement obtenir le produit final souhaité, de sorte que la recombinase reconnaisse la séquence que nous avons définie dans l'LTR. Nous commençons donc, comme je l'ai dit, avec une bibliothèque de mutagénèse aléatoire. Cela est généralement réalisé par PCR sujette à erreur.

Nous utilisons donc des conditions de PCR qui, par exemple, avec une polymérase peu fidèle, engendrent de nombreuses erreurs. De cette manière, nous générons une bibliothèque aléatoire portant des mutations dispersées un peu partout. Nous pouvons également utiliser une souche mutagène, une souche bactérienne mutagène, qui induit de nombreuses mutations dans certains transcrits.

Et ceux-ci sont ensuite utilisés comme matériau de départ. L'autre technologie que nous utilisons consiste, après un certain temps, à effectuer un réarrangement de l'ADN. Il s'agit essentiellement d'une technique qui permet de combiner différentes mutations avantageuses, car on ne sait pas précisément laquelle des mutations est bénéfique, mais on obtient différents mutants porteurs de mutations différentes.

Vous avez donc un gène qui présente une mutation ici, laquelle est bénéfique. Vous disposez d'un second clone qui possède une mutation à cet autre endroit, et afin de combiner ces deux mutations, vous effectuez maintenant une fragmentation aléatoire des différents fragments, puis vous les réunissez dans une réaction PCR afin de réassembler les produits. Et désormais, vous obtiendrez à une certaine fréquence une combinaison des deux, dans laquelle une partie de la recombinaison provient de ce mutant et l'autre partie provient de cet autre mutant.

Ensuite, cet élément ici aura un effet supplémentaire qui permettra d'améliorer la sélection et, ainsi, de choisir beaucoup plus rapidement les candidats possédant les propriétés souhaitées. Je définirais donc la situation en précisant que la protéine de type sauvage n'a absolument aucune activité sur un site donné. Par exemple, si nous prenons notre séquence sélectionnée dans la région LTR du VIH-1, et que nous appliquons la recombinase Cre sur cette séquence, il n'y aura absolument aucune activité.

La recombinase CRE n'est pas capable de recombiner le site, et vous avez, par définition, une nouvelle recombinase lorsque vous obtenez alors une enzyme capable de se lier à ce site et de le recombiner. Nous n'avions pas prédéfini le nombre de cycles que nous allions effectuer, mais nous avons réalisé autant de cycles que nécessaire jusqu'à l'obtention d'une enzyme présentant l'activité souhaitée. Nous avons donc commencé par des mutations très mineures au niveau du site, puis nous avons commencé à combiner entre elles les différentes mutations.

Cette étape constituait l'une des étapes importantes expliquant le fonctionnement de ce processus. Nous avons donc parcouru plusieurs intermédiaires et dû effectuer de nombreux cycles afin d'obtenir une enzyme suffisamment active pour passer au cycle suivant. Cela ressemble fortement à tout processus de sélection.

Vous définissez une activité précise souhaitée, une caractéristique spécifique désirée, puis vous commencez l'élevage. Et tant que vous n'obtenez pas ce que vous vouliez, vous n'êtes pas au but et vous devez effectuer davantage de générations. C'est fondamentalement en cela que cela consiste.

Je devrais également préciser que les 120 cycles d'évolution, ou cent vingt-huit précisément, visaient simplement à identifier une étape intermédiaire où nous avons déclaré : « maintenant, nous pouvons arrêter, car nous avons une certaine activité ». Les recombinases que nous possédons actuellement sont encore moins actives que la recombinase CRE sur son site de type sauvage. Ainsi, afin d'obtenir une recombinase plus active, nous devrions effectuer davantage de cycles d'évolution.

Ainsi, cela ne se termine fondamentalement pas là où nous en sommes actuellement dans le processus d'évolution. Je ne vois aucune limitation technique. Il est toutefois douteux jusqu'où on peut pousser cela.

Ainsi, les sites LTR, c'est-à-dire la séquence que l'on trouve dans le LTR HA, partagent une similarité de séquence de 50 % avec le site naturel P, le côté naturel que la recombinaise reconnaît pour effectuer la recombinaison. La question est donc de savoir si l'on peut aller encore plus loin ; nous ne le savons pas encore, mais le fait que nous n'ayons qu'une similarité de séquence de 50 % par rapport au site de type sauvage suggère que l'on pourrait pousser davantage. La recombinase fonctionne bien dans des cellules humaines en culture, même si, comme je l'ai dit, elle n'est pas tout à fait aussi active que la recombinase query sur son site spécifique.

La stabilité est donc probablement un peu inférieure à celle de la recombinase d'interrogation, c'est-à-dire de l'enzyme de type sauvage, et une sélection plus poussée ainsi que davantage de cycles d'évolution seraient nécessaires pour améliorer ces caractéristiques à l'avenir. La première étape consiste donc à améliorer le site, cette recombinase spécifique, la recombinase trois, à la rendre plus active, et peut-être à identifier d'autres sites très marqués qui constitueraient de bons cibles dans un LTR, puis à trouver une excellente recombinase pour cela. Nous devrions ensuite tester cette recombinase dans différents dosages, d'abord à nouveau dans des cellules en culture tissulaire, mais surtout dans des modèles animaux.

Nous devrions donc vérifier si cette recombinase présente des effets secondaires indésirables dans un organisme. Et puis, bien sûr, un aspect très difficile consiste à mettre au point un bon système de délivrance pour cette recombinase, ce qui n'est pas trivial. C'est en soi un domaine de recherche à part entière à développer.

Il s'agissait fondamentalement d'une approche de thérapie génique que nous devions adopter. Eh bien, je pense que nous assistons à un virage de la médecine vers une approche de plus en plus moléculaire. Et pour cela, bien sûr, nous avons besoin d'outils permettant de travailler à une telle échelle.

Et c’est précisément là que je situe l’avenir du processus évolutif. Nous devons donc concevoir des enzymes sur mesure capables d’agir sur un processus que nous souhaitons vraiment pouvoir exploiter. Dans le cas de la recombinase, on pourrait considérer cela comme une analogie à un outil destiné à un chirurgien qui doit exciser, lors d’une opération, un élément donné. Ici, nous avons besoin d’outils permettant à un chirurgien moléculaire de supprimer de façon ciblée un fragment particulier d’ADN au sein du génome.

Et pour cela, il a besoin des outils permettant de réaliser cette tâche. L'évolution moléculaire peut donc fondamentalement remplir cette fonction. De nombreuses enzymes existent dans la nature et possèdent des propriétés très intéressantes pour accomplir cela.

Et nous devons simplement les adapter à nos besoins afin de pouvoir les rendre utiles. Je pense que l'évolution moléculaire peut jouer un rôle très important ici. Il est difficile de déterminer actuellement quelles en sont les limites, car cette technologie, ce domaine, en est encore à ses débuts.

Le temps dira où se situent les limites. Je suis certain qu'il y en aura quelques-unes, mais pour l'instant, je pense qu'il existe davantage d'opportunités que de véritables limitations.