Name: Interview: le VIH-1 Excision ADN proviral utilisant une recombinase Evolved (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-16T23:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Découvrez l'excision de l'ADN proviral du VIH-1 à l'aide d'une recombinase évolutive. Cette méthode innovante élimine le virus intégré des cellules infectées et ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le VIH.

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S&#39;il vous plaît voir les vidéos liées intitulé <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=718" target="_blank">Principes de la recombinase site-spécifique (SSR) Technologie</a> et <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=791" target="_blank">Evolution Moléculaire de la recombinase Tre</a> pour plus d&#39;informations sur recombinaison spécifique de site et de l&#39;ingénierie de la spécificité du site d&#39;enzymes recombinase.

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

interview: le vih-1 excision adn proviral utilisant une recombinase evolved

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

VIH-1 s&#39;intègre dans le chromosome hôte des cellules infectées et persiste comme un provirus flanqué de longues répétitions terminales. Stratégies de traitement actuelles ciblent principalement les enzymes ou le virus de fusion cellulaire, supprimant le cycle de vie viral sans éradiquer l&#39;infection. Depuis le provirus intégré n&#39;est pas ciblée par ces approches, de nouvelles souches résistantes de VIH-1 peuvent émerger. Ici, nous déclarons que la recombinase Tre conçu (voir l&#39;évolution moléculaire de la recombinase Tre, Buchholz, F., Institut Max Planck pour la biologie cellulaire et génétique, Dresde) excise efficacement l&#39;ADN intégré le VIH-1 proviral dans le génome des cellules infectées. Nous avons produit contenant loxLTR pseudotypes viraux et des cellules HeLa infectées d&#39;examiner si Tre recombinase peut accise du provirus dans le génome du VIH-1 cellules humaines infectées. Une lignée cellulaire du virus de particules de libération a été cloné et transfectées avec un plasmide exprimant Tre ou avec un vecteur de contrôle parental. L&#39;activité recombinase et la production de virus ont été surveillés. Tous les tests ont démontré la suppression efficace des provirus partir de cellules infectées, sans effets cytotoxiques visibles. Ces résultats servent de preuve de principe qu&#39;il est possible de faire évoluer une recombinase de cibler spécifiquement une LTR du VIH-1 et que cette recombinase est capable d&#39;exciser les provirus VIH-1 à partir du génome du VIH-1-cellules humaines infectées. Avant une recombinase modifiés pourraient entrer dans le domaine thérapeutique, cependant, d&#39;importants obstacles doivent être surmontés. Parmi les problèmes les plus critiques, que nous devons faire face, sont une prestation efficace et sûr pour les cellules ciblées et l&#39;absence d&#39;effets secondaires.

Courant VIH-1 stratégies agir pour supprimer le cycle de vie du virus mais ne éradiquer efficacement l&#39;infection. Ici, nous démontrons que l&#39;ingénierie peut ADN recombinase efficacement accise intégré le VIH-1 proviral dans le génome des cellules infectées.

Interview: le VIH-1 Excision ADN proviral utilisant une recombinase Evolved

Le VIH-1 s'intègre dans le chromosome de l'hôte des cellules infectées et persiste sous forme de provirus flanqué de répétitions terminales longues. Les stratégies thérapeutiques actuelles...

Je m'appelle JohE Hvar et je me rends au Département de biologie cellulaire et de biologie, à l'Institut HE Pet à Hambourg, en Allemagne. L'Institut HE PET est un institut de recherche fondamentale axé exclusivement sur les virus humains pathogènes et, oui, sur les questions connexes, dirais-je. Notre département s'intéresse principalement à l'étude de la régulation de l'expression génique du VIH, ainsi qu'aux interactions, en particulier intracellulaires, entre le VIH et les composants de la cellule hôte.Sur la base de ces données, nous essayons également de développer de nouvelles thérapies expérimentales contre la maladie à VIH. Le problème posé par le VIH est qu’il s’agit d’un rétrovirus ou d’un lentivirus, et comme tout rétrovirus, le VIH intègre, lors de l’infection de la cellule hôte, le génome viral dans le génome de la cellule hôte. Jusqu’à présent, on ne peut plus se débarrasser du provirus intégré.Cela signifie que, en termes de thérapie, nous parlons d'une maladie chronique nécessitant un traitement à vie, et donc de tous les problèmes liés aux thérapies à long terme, tels que les effets secondaires des médicaments, l'apparition de résistances, etc. Eh bien, depuis de nombreuses années, la recherche fondamentale connaît des recombinases, naturellement présentes dans des processus de recombinaison comme chez la levure ou chez les bactéries, par exemple. Ces recombinases reconnaissent des séquences d'ADN spécifiques et réorganisent les gènes, réarrangent le génome, et ainsi de suite.Et particulièrement, une recombinase appelée CRE est utilisée dans la recherche fondamentale in situ. CRE reconnaît essentiellement une séquence spécifique. Et si vous avez une séquence située entre deux sites de reconnaissance, CRE est capable d'exciser la séquence intermédiaire.L'idée, déjà ancienne de 10 à 15 ans, consiste d’un côté à éradiquer le virus dans le domaine de la médecine, et de l’autre, à utiliser des enzymes comme des recombinases, par exemple celle de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, afin d’exciser le provirus ADN. Ceci devrait être théoriquement possible car, lors de l’infection, le VIH réalise une transcription inverse de son génome ARN en ADN. Ce processus de transcription inverse génère des séquences appelées répétitions terminales longues (LTR), qui marquent essentiellement les extrémités 5' (début) et 3' (fin) du provirus intégré à l’ADN. Ainsi, en théorie, si l’on pouvait concevoir une recombinaison spécifique ciblant une séquence présente dans les LTR, cette recombinase attaquerait les extrémités 5' et 3' du provirus intégré, exciserait l’ADN intermédiaire et éradiquerait ainsi le virus de la cellule infectée. Or, le problème avec le VIH est qu’il existe différents isolats, même au sein d’un seul individu, d’un seul patient. Toutefois, comme nous le savons jusqu’à présent, la séquence des LTR est conservée au début et à la fin du génome viral.Autrement dit, les LTR sont plus conservés que, par exemple, les gènes du VIH. Je pense donc qu'il y a de bonnes chances que nous puissions nous contenter d'un petit nombre de recombinants qui reconnaissent essentiellement la grande majorité de tous les isolats de VIH. Et sinon, fondamentalement, nous devrons en générer un nouveau par évolution moléculaire, ce qui pourrait à l'avenir être semi-automatisé.Et cela, le processus sera beaucoup plus rapide que de le faire en laboratoire. Notre collègue, le Dr Frank de l'Institut Max Splunk, est alors entré en scène. Fondamentalement, il est un expert en recombinases et en tout ce qui s'y rapporte.Fondamentalement, ce qu'il a utilisé est ce que nous appelons une méthode d'évolution moléculaire. Mais cette méthode repose sur la technologie de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Il prend le gène de la recombinase naturelle degree combs et met en place une réaction PCR, ou plusieurs réactions PCR, dans des conditions qui introduisent de manière aléatoire des mutations.Et le principe consiste désormais à sélectionner les nouvelles versions de la recombinase ayant acquis une capacité ou une activité nouvelle, à savoir la reconnaissance de séquences spécifiques du VIH. Il effectue cela en cycles réitérés. Il a réalisé environ 120 cycles, voire plus, pour appliquer cette méthode d'évolution moléculaire.Lorsqu'il a finalement mis au point ce recombinant spécifique, maintenant appelé trois pour la recombinaison spécifique de l'LTR, avec ce nouveau recombinant qui reconnaît désormais spécifiquement les séquences du VIH. L'étude initiale a donc consisté en des expériences avec ces recombinants, réalisées ici à l'Institut HE PET à Hambourg. Ce que nous avons fait, c'est notamment d'administrer ce recombinant à l'aide de vecteurs, des vecteurs génétiques, dans des cultures cellulaires humaines qui avaient été infectées par un isolat plus ou moins clinique du VIH-1.Et au fil du temps, sur une période de six à huit semaines, nous avons pu le démontrer. À présent, le fait de recourir à la recombinaison est quantitativement prometteur : le profil d'intégration du VIH est éliminé, et fondamentalement, toute la culture est guérie grâce à l'éradication du VIH. Cette technologie présente certainement de nombreux problèmes.Tout d'abord, nous devons nous assurer que l'expression de la recombinase ne provoque pas d'effets secondaires toxiques. Nous n'en attendons pas, car pour des recombinaisons naturelles comme gre, il existe des animaux transgéniques dits « transgéniques ». Ils expriment cette recombinaison GRE et, bon, il existe certains problèmes, mais pas trop importants.Je peux le dire à ce stade. Il y a donc de l'espoir qu'il n'y ait pas d'effets secondaires toxiques, mais on ne peut jamais savoir tant que les expériences n'ont pas été réalisées. De plus, il existe des problèmes potentiels : par exemple, nous risquons de ne pas reconnaître chaque isolat clinique, ce qui pourrait nous empêcher d'éliminer l'isolat dominant, l'isolat VIH, chez un patient.Mais nous sélectionnerons au fil du temps un isolat mineur, mineur. C'est quelque chose que nous ne savons pas ; nous devons réaliser ces expériences. Ensuite, il existe un grand problème lié à la livraison des gènes, avec la technologie des vecteurs.Nous devons utiliser des vecteurs dits lentiviraux ou également des vecteurs rétroviraux pour délivrer le gène ou le gène de recombinase. Existe-t-il des effets secondaires ? Oui. Ces vecteurs provoquent-ils des effets toxiques ?Voici toutes les questions que nous avons. En outre, nous espérons améliorer l'activité des peignes. En effet, la recombinaison agit plus rapidement que ce que nous observons actuellement, en l'espace de quelques semaines, l'activité.Ces questions restent donc ouvertes et devront être approfondies au cours des prochaines années. Et c’est désormais un problème certain, car les recombinases ne sont pas disponibles par voie orale. Il n’y aura donc pas de pilule, de pilule à base de recombinase, tout simplement, qui permettrait de se débarrasser du virus.Donc, en spéculant sur les thérapies futures, nous devons envisager des approches de thérapie génique. Peut-être peut-on imaginer que nous isolons des cellules souches hématopoïétiques, ou cellules positives pour le CD34, à partir du sang de patients infectés par le VIH. Puis, en laboratoire, nous introduisons le gène des ciseaux moléculaires dans les cellules de ces patients.Enfin, nous réintroduisons, nous réinjectons les cellules du patient – nous réinfusons les cellules génétiquement modifiées du patient dans le même patient. Ce qui devrait se produire, c’est que le système immunitaire ou le système hématopoïétique du patient se reconstitue au fil du temps, au moins partiellement, avec des cellules capables, lors d'une infection par le VIH, d'éliminer le virus, car elles expriment désormais une recombinase. L'effet attendu serait donc une diminution de la charge virale chez le patient, ce qui améliorerait certainement sa qualité de vie.Et nous pouvons également espérer que le système immunitaire se reconstitue chez ces patients, au moins partiellement. Ainsi, désormais, la, la, la fonction, les cellules immunitaires entièrement fonctionnelles devraient, espérons-le, être capables d'attaquer les cellules restantes de façon chronique chez ces patients. Quant à savoir si nous pouvons réellement éliminer complètement et totalement le VIH chez un patient, nous ne pouvons pas le dire à l'heure actuelle.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous rapportons ici la génération de Tre recombinase travers dirigé, l'évolution moléculaire. Tre recombinase reconnaît une séquence cible pré-définie dans les séquences LTR du provirus VIH-1, résultant en l'excision et l'éradication du provirus de cellules humaines infectées. Alors qu'il était encore à ses balbutiements, l'évolution moléculaire dirigée va permettre la création d'enzymes personnalisées qui serviront d'outils moléculaires de la chirurgie et la médecine moléculaire.

Molecular Evolution de la recombinase Tre

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

La compétition de croissance entre virus quasi isogéniques fournit une mesure sensible pour déterminer la valeur relative de réplication. Les protocoles décrits ici comprennent la construction de clones recombinants du VIH-1, la propagation et la compétition de croissance du virus et des méthodes d’analyse optimisées pour produire des résultats sensibles et cohérents.

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

Nous décrivons un protocole permettant d’amplifier les sites d’intégration rétrovirale à partir de l’ADN génomique des cellules infectées, de séquencer les jonctions virus-hôte amplifiées, puis de cartographier ces séquences sur un génome de référence. Nous décrivons également des techniques pour quantifier la distribution des sites d’intégration par rapport à diverses annotations génomiques à l’aide de BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Ce manuscrit décrit la procédure expérimentale et l'analyse de logiciel pour un test de site d'intégration bidirectionnelle qui peut analyser simultanément l'ADN de jonction vecteur-hôte en amont et en aval. Les produits de PCR bidirectionnels peuvent être utilisés pour toute plate-forme de séquençage en aval. Les données résultantes sont utiles pour une comparaison quantitative à haut débit des cibles intégrées d'ADN.

Site d&#39;intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

Pleine longueur séquençage proviral individuel (FLIPS) fournit une méthode efficace et haut débit pour l’amplification et le séquençage d’unique, près de provirus pleine longueur de VIH-1 (intactes ou défectueux) et permettant la détermination de leur potentiel réplication-compétences. FLIPS surmonte les limites des tests précédents conçus pour séquencer le réservoir latent de VIH-1.

Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

Nous présentons un flux de travail de génie du génome pour la génération de nouveaux modèles in vitro pour l’infection à VIH-1 qui récapitulent l’intégration provirale dans certains sites génomiques. Ciblage des journalistes dérivé du VIH est facilitée par la manipulation du génome CRISPR Cas9-médiation, in situ. Des protocoles détaillés pour la génération de cellule unique clone, dépistage et vérification de ciblage correcte sont fournis.

Génie de génome CRISPR dotés de Cas9 pour produire des modèles de Jurkat Reporter pour l’Infection à VIH-1 avec les Sites d’intégration Proviral sélectionnés

Nous présentons une approche de séquençage en profondeur qui fournit une détermination impartiale du naissant 3'-termini ainsi que des profils de mutations des molécules d’ADN simple brin. L’application principale est la caractérisation de naissants DNAs rétrovirales complémentaires (ADNc), les intermédiaires générés lors du processus de transcription inverse rétrovirale.

Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.

Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage

Le protocole décrit une méthode permettant d’introduire une diversité génétique contrôlable dans le génome du virus de l’hépatite C en combinant la synthèse d’ARN mutant sur toute la longueur à l’aide de la PCR sujette aux erreurs et de la génétique inverse. La méthode fournit un modèle pour la sélection phénotypique et peut être utilisée pour les génomes de virus à ARN à sens positif de 10 kb de long.

La génétique inverse pour concevoir des variants du virus à ARN à sens positif

Découvrez l'excision de l'ADN proviral du VIH-1 à l'aide d'une recombinase évolutive. Cette méthode innovante élimine le virus intégré des cellules infectées et ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le VIH.

Interview: le VIH-1 Excision ADN proviral utilisant une recombinase Evolved

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