Interview: le VIH-1 Excision ADN proviral utilisant une recombinase Evolved

Je m'appelle JohE Hvar et je me rends au Département de biologie cellulaire et de biologie, à l'Institut HE Pet à Hambourg, en Allemagne. L'Institut HE PET est un institut de recherche fondamentale axé exclusivement sur les virus humains pathogènes et, oui, sur les questions connexes, dirais-je. Notre département s'intéresse principalement à l'étude de la régulation de l'expression génique du VIH, ainsi qu'aux interactions, en particulier intracellulaires, entre le VIH et les composants de la cellule hôte.

Sur la base de ces données, nous essayons également de développer de nouvelles thérapies expérimentales contre la maladie à VIH. Le problème posé par le VIH est qu’il s’agit d’un rétrovirus ou d’un lentivirus, et comme tout rétrovirus, le VIH intègre, lors de l’infection de la cellule hôte, le génome viral dans le génome de la cellule hôte. Jusqu’à présent, on ne peut plus se débarrasser du provirus intégré.

Cela signifie que, en termes de thérapie, nous parlons d'une maladie chronique nécessitant un traitement à vie, et donc de tous les problèmes liés aux thérapies à long terme, tels que les effets secondaires des médicaments, l'apparition de résistances, etc. Eh bien, depuis de nombreuses années, la recherche fondamentale connaît des recombinases, naturellement présentes dans des processus de recombinaison comme chez la levure ou chez les bactéries, par exemple. Ces recombinases reconnaissent des séquences d'ADN spécifiques et réorganisent les gènes, réarrangent le génome, et ainsi de suite.

Et particulièrement, une recombinase appelée CRE est utilisée dans la recherche fondamentale in situ. CRE reconnaît essentiellement une séquence spécifique. Et si vous avez une séquence située entre deux sites de reconnaissance, CRE est capable d'exciser la séquence intermédiaire.

L'idée, déjà ancienne de 10 à 15 ans, consiste d’un côté à éradiquer le virus dans le domaine de la médecine, et de l’autre, à utiliser des enzymes comme des recombinases, par exemple celle de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, afin d’exciser le provirus ADN. Ceci devrait être théoriquement possible car, lors de l’infection, le VIH réalise une transcription inverse de son génome ARN en ADN. Ce processus de transcription inverse génère des séquences appelées répétitions terminales longues (LTR), qui marquent essentiellement les extrémités 5' (début) et 3' (fin) du provirus intégré à l’ADN. Ainsi, en théorie, si l’on pouvait concevoir une recombinaison spécifique ciblant une séquence présente dans les LTR, cette recombinase attaquerait les extrémités 5' et 3' du provirus intégré, exciserait l’ADN intermédiaire et éradiquerait ainsi le virus de la cellule infectée. Or, le problème avec le VIH est qu’il existe différents isolats, même au sein d’un seul individu, d’un seul patient. Toutefois, comme nous le savons jusqu’à présent, la séquence des LTR est conservée au début et à la fin du génome viral.

Autrement dit, les LTR sont plus conservés que, par exemple, les gènes du VIH. Je pense donc qu'il y a de bonnes chances que nous puissions nous contenter d'un petit nombre de recombinants qui reconnaissent essentiellement la grande majorité de tous les isolats de VIH. Et sinon, fondamentalement, nous devrons en générer un nouveau par évolution moléculaire, ce qui pourrait à l'avenir être semi-automatisé.

Et cela, le processus sera beaucoup plus rapide que de le faire en laboratoire. Notre collègue, le Dr Frank de l'Institut Max Splunk, est alors entré en scène. Fondamentalement, il est un expert en recombinases et en tout ce qui s'y rapporte.

Fondamentalement, ce qu'il a utilisé est ce que nous appelons une méthode d'évolution moléculaire. Mais cette méthode repose sur la technologie de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Il prend le gène de la recombinase naturelle degree combs et met en place une réaction PCR, ou plusieurs réactions PCR, dans des conditions qui introduisent de manière aléatoire des mutations.

Et le principe consiste désormais à sélectionner les nouvelles versions de la recombinase ayant acquis une capacité ou une activité nouvelle, à savoir la reconnaissance de séquences spécifiques du VIH. Il effectue cela en cycles réitérés. Il a réalisé environ 120 cycles, voire plus, pour appliquer cette méthode d'évolution moléculaire.

Lorsqu'il a finalement mis au point ce recombinant spécifique, maintenant appelé trois pour la recombinaison spécifique de l'LTR, avec ce nouveau recombinant qui reconnaît désormais spécifiquement les séquences du VIH. L'étude initiale a donc consisté en des expériences avec ces recombinants, réalisées ici à l'Institut HE PET à Hambourg. Ce que nous avons fait, c'est notamment d'administrer ce recombinant à l'aide de vecteurs, des vecteurs génétiques, dans des cultures cellulaires humaines qui avaient été infectées par un isolat plus ou moins clinique du VIH-1.

Et au fil du temps, sur une période de six à huit semaines, nous avons pu le démontrer. À présent, le fait de recourir à la recombinaison est quantitativement prometteur : le profil d'intégration du VIH est éliminé, et fondamentalement, toute la culture est guérie grâce à l'éradication du VIH. Cette technologie présente certainement de nombreux problèmes.

Tout d'abord, nous devons nous assurer que l'expression de la recombinase ne provoque pas d'effets secondaires toxiques. Nous n'en attendons pas, car pour des recombinaisons naturelles comme gre, il existe des animaux transgéniques dits « transgéniques ». Ils expriment cette recombinaison GRE et, bon, il existe certains problèmes, mais pas trop importants.

Je peux le dire à ce stade. Il y a donc de l'espoir qu'il n'y ait pas d'effets secondaires toxiques, mais on ne peut jamais savoir tant que les expériences n'ont pas été réalisées. De plus, il existe des problèmes potentiels : par exemple, nous risquons de ne pas reconnaître chaque isolat clinique, ce qui pourrait nous empêcher d'éliminer l'isolat dominant, l'isolat VIH, chez un patient.

Mais nous sélectionnerons au fil du temps un isolat mineur, mineur. C'est quelque chose que nous ne savons pas ; nous devons réaliser ces expériences. Ensuite, il existe un grand problème lié à la livraison des gènes, avec la technologie des vecteurs.

Nous devons utiliser des vecteurs dits lentiviraux ou également des vecteurs rétroviraux pour délivrer le gène ou le gène de recombinase. Existe-t-il des effets secondaires ? Oui. Ces vecteurs provoquent-ils des effets toxiques ?

Voici toutes les questions que nous avons. En outre, nous espérons améliorer l'activité des peignes. En effet, la recombinaison agit plus rapidement que ce que nous observons actuellement, en l'espace de quelques semaines, l'activité.

Ces questions restent donc ouvertes et devront être approfondies au cours des prochaines années. Et c’est désormais un problème certain, car les recombinases ne sont pas disponibles par voie orale. Il n’y aura donc pas de pilule, de pilule à base de recombinase, tout simplement, qui permettrait de se débarrasser du virus.

Donc, en spéculant sur les thérapies futures, nous devons envisager des approches de thérapie génique. Peut-être peut-on imaginer que nous isolons des cellules souches hématopoïétiques, ou cellules positives pour le CD34, à partir du sang de patients infectés par le VIH. Puis, en laboratoire, nous introduisons le gène des ciseaux moléculaires dans les cellules de ces patients.

Enfin, nous réintroduisons, nous réinjectons les cellules du patient – nous réinfusons les cellules génétiquement modifiées du patient dans le même patient. Ce qui devrait se produire, c’est que le système immunitaire ou le système hématopoïétique du patient se reconstitue au fil du temps, au moins partiellement, avec des cellules capables, lors d'une infection par le VIH, d'éliminer le virus, car elles expriment désormais une recombinase. L'effet attendu serait donc une diminution de la charge virale chez le patient, ce qui améliorerait certainement sa qualité de vie.

Et nous pouvons également espérer que le système immunitaire se reconstitue chez ces patients, au moins partiellement. Ainsi, désormais, la, la, la fonction, les cellules immunitaires entièrement fonctionnelles devraient, espérons-le, être capables d'attaquer les cellules restantes de façon chronique chez ces patients. Quant à savoir si nous pouvons réellement éliminer complètement et totalement le VIH chez un patient, nous ne pouvons pas le dire à l'heure actuelle.