Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Les cellules souches ont le potentiel remarquable de se développer en de nombreux types de cellules différents dans le corps. Servant comme une sorte de système de réparation pour le corps. Ils peuvent théoriquement se diviser sans limite pour reconstituer d’autres cellules.

Lorsqu’une cellule souche se divise, chaque nouvelle cellule a le potentiel de rester une cellule souche ou de devenir un autre type de cellule avec une fonction plus spécialisée. Ce domaine scientifique prometteur amène les scientifiques à étudier la possibilité de thérapies cellulaires pour traiter les maladies in vitro. La différenciation des cellules souches embryonnaires se produit lorsque les cellules sont autorisées à s’agréger en culture en suspension.

En l’absence d’embryons de souris, de fibroblastes et de facteur inhibiteur de leucémie, ces agrégats cellulaires sont appelés corps embryonnaires. La méthode de la goutte suspendue est une procédure efficace pour la différenciation des cellules souches en corps embryonnaires in vitro. Bonjour, je m’appelle Sha Juan et je travaille à gaucher dans la division de médecine cardiovasculaire de l’Université de Stanford.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de différenciation individuelle des cellules souches embryonnaires pour exprimer le corps en utilisant la méthode de la chute manuelle. Nous utilisons généralement cette méthode pour différencier les cellules souches embryonnaires en cardiomyocytes. Cette procédure, qui comprend les étapes suivantes, comprend la préparation d’une suspension unicellulaire de cellules souches embryonnaires, la génération de cultures de gouttes à la main, le transfert de cultures de gouttes à la main sur des plaques à très faible fixation et le placage des corps brodés sur des plaques revêtues de jute.

D’accord, commençons. La première étape de la procédure consiste à préparer une suspension unicellulaire de cellules souches embryonnaires. Parce que nous cultivons nos cellules souches embryonnaires indifférenciées en les cultivant sur des fibroblastes embryonnaires de souris, nous devons détacher les cellules et les séparer des fibroblastes.

Pour ce faire, nous essayons d’aniser les cellules en utilisant des procédures standard. Une fois l’essai et le traitement terminés, ajoutez un milieu de cellules souches embryonnaires de souris pour neutraliser la trypsine. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mil.

Ensuite, brisez les colonies cellulaires en pipetant de haut en bas contre le fond du tube jusqu’à obtenir une fine suspension de cellules sans amas visibles. Maintenant, faites tourner les cellules à mille tours par minute pendant cinq minutes. Après avoir fait tourner, les cellules aspirent le supernat et remettent en suspension les cellules avec 10 mils de cellules ES de souris. Douleur moyenne.

Transférez la suspension cellulaire dans une fiole T 75 précodée avec 0,1 % de gélatine et incubez à 37 degrés avec 5 % de CO2 pendant une heure. Au bout d’une heure, les fibroblastes se sont attachés à la plaque, mais les cellules souches restent dans le milieu. Pipetez le milieu pour recueillir les cellules souches.

Faites tourner les cellules à mille tr/min pendant cinq minutes et aspirez le fluide. Ajoutez ensuite 10 mils supplémentaires de milieu de différenciation et remettez les cellules en suspension par pipetage répétitif jusqu’à ce qu’il semble y avoir une fine suspension de cellules. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Nous sommes maintenant prêts à cultiver la suspension cellulaire en utilisant la méthode de la goutte suspendue. Pour commencer la culture en gouttes suspendues, utilisez la médiane de différenciation pour diluer la suspension de cellules souches à une concentration de 500 cellules par 20 microlitres. Ensuite, retournez un couvercle de plaque de culture tissulaire de 150 millimètres.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de la suspension cellulaire sur la surface intérieure du couvercle de la plaque. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 10 mils de PBS sur la plaque. Retournez rapidement le couvercle de l’assiette et placez-le doucement sur l’assiette pour former les gouttes suspendues.

Une fois le couvercle de la plaque en place, transférez soigneusement la plaque dans la culture de l’incubateur. Les cellules n’ont pas été dérangées pendant deux jours. Une fois l’incubation terminée, nous procéderons au transfert de la culture de gouttes suspendues sur des plaques de fixation ultra basses.

Après deux jours, retournez soigneusement le couvercle de la plaque, puis aspirez 180 microlitres de milieu de différenciation frais et placez plusieurs gouttes dans une plaque de fixation ultra basse de 96 puits. Ensuite, prélevez les gouttes à l’aide d’une pipette et transférez-les une par une sur la plaque à 96 puits. Placez les plaques dans l’incubateur sans les déranger pendant trois jours.

Les corps embryonnaires continueront à croître en forme de boule. Lorsque l’incubation sera terminée, nous serons prêts à plaquer les corps embryonnaires. Afin d’aider les corps embryonnaires à continuer à se différencier.

Nous les transférons dans une plaque recouverte de gélatine de 48 puits. Pour ce faire, nous enduisons d’abord chaque puits de la plaque avec 300 microlitres de gélatine à 0,1 %. Après avoir ajouté la gélatine, incubez l’assiette pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, aspirez la gélatine de la plaque à 48 puits. Ajoutez ensuite 300 microlitres de milieu de différenciation à chacun. Eh bien, maintenant, transférez un par un les corps embryonnaires des plaques recouvertes de gélatine à 96 puits aux plaques recouvertes de gélatine à 48 puits.

Nous changeons généralement le milieu le lendemain, puis tous les deux jours pour maintenir les cellules. Nous utilisons cette méthode pour rechercher de meilleurs protocoles de différenciation des cellules souches embryonnaires. Dans le domaine des cardiomyocytes, nous venons de vous montrer comment effectuer la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de cultures de gouttes suspendues.

Cette méthode est efficace car le fond rond de la goutte suspendue permet l’agrégation des cellules souches embryonnaires, fournissant ainsi un bon environnement pour la formation des corps d’Embry. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que le nombre de cellules souches embryonnaires agrégées dans une goutte suspendue peut être contrôlé en faisant varier le nombre de cellules dans la suspension cellulaire initiale. Voilà.

Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans votre expérience.