Name: Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris par la méthode de goutte suspendue. Cette technique permet la formation de corps embryonnaires pour la recherche en médecine régénérative.

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<ol><li> Gélatiniser flacon T75 en utilisant une solution à 0,1% de gélatine et de la plaque incuber dans une 37 ° C, le CO 2 de la culture incubateur à 5% du tissu nuit un jour avant. </li><li> Sortez les cellules d&#39;incubation MES, aspirer le milieu, rincer la culture de cellules ES avec PBS, ajouter la solution de trypsine 0,05% à recouvrir le fond du plat (2 plaques ml/100mm). </li><li> Incuber à 37 ° C pendant environ 1 minute, jusqu&#39;à ce que les cellules sont desquamation de la plaque. </li><li> Doucement triturer (pipette de haut en bas), les cellules trypsinisées quatre à six fois pour disperser les cellules ES avec une pipette Pasteur branché,. Transférer les cellules ES dispersés dans un tube de 15 ml à centrifuger conique contenant préchauffée (37 ° C) moyenne MES. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation. Aspirer le surnageant, ajouter 10 ml de milieu de MES et la pipette de haut en bas pour former une suspension cellulaire unique. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un flacon T75 pré-enduites de gélatine à 0,1% et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant une heure * Après une heure, les fibroblastes ont attaché à la plaque, mais les cellules souches restent dans le milieu. Pipeter le moyen de recueillir les cellules souches. </li><li> Faites tourner les cellules à 1000 rpm pendant 5 min et aspirer hors du milieu MES. Puis ajouter un autre 10 ml de milieu de différenciation MES et remettre les cellules par pipetage répétitifs jusqu&#39;à ce qu&#39;il semble y avoir une suspension fine de cellules. </li><li> Compter les cellules avec un milieu de différenciation hémocytomètre utiliser pour diluer la suspension de cellules souches à une concentration de 400 à 500 cellules par 20ul (20ul/drop) dans un bassin de stériles. </li><li> Soulevez le couvercle soigneusement l&#39;inverser et la placer sur le dessus du plat contenant 10 ml de PBS. En utilisant une pipette multicanaux, faire des rangées de gouttes sur la surface de 20ul retroussé intérieure du couvercle de la boîte de culture tissulaire. </li><li> Placez délicatement le plat dans l&#39;incubateur pendant 2 jours. Après deux jours, soigneusement tourner sur la plaque de couverture, aspirez 180 ul moyenne de différenciation fraîche et mettre quelques gouttes dans le puits d&#39;une plaque de 96 puits ultra attachement. Puis le micro de la goutte avec les gouttes de pipette et de transfert, un par un, à la plaque de 96 puits. Placer les plaques dans le reposer pendant 3 jours d&#39;incubation. </li><li> Enrober chaque puits d&#39;une plaque de 48 puits de culture de tissu avec 300ul de 0,1% de gélatine. Après l&#39;ajout de la gélatine, incuber la plaque pendant la nuit à 37 ° C un jour en avance avant le transfert de l&#39;EBS. </li><li> Le lendemain, aspirer les feuilles de gélatine de la plaque de 48 puits. Puis ajouter 300 ul de milieu de différenciation à chaque puits. Transfert l&#39;EBS de la plaque de 96 puits aux 48 et la gélatine des plaques revêtues un par un. Changer le support le jour suivant et ensuite changer le milieu tous les autres jours pour maintenir les cellules. </li><li> Spontanée contractions cardiaomyocyte devrait être évident dans les 7 jours. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

Les inconvénients de la méthode de la goutte suspendue sont les suivants: le volume de liquide d&#39;une baisse est limitée à moins de 50ul due au maintien de gouttes suspendues sur le couvercle par la tension de surface, et il est impossible de changer le milieu des gouttes pendantes. Observation de former EBS gouttes directement avec la microscopie est également très difficile pendant la culture. Plus loin plus, la méthode de la goutte suspendue compose de deux étapes, par conséquent, une série d&#39;étapes de la méthode de la goutte susp...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Réactif</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline / Streptomycine</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Réactif</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF)</td><td>Réactif</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 96 puits à attachement ultrabas</td><td>Outil</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (mes) cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Les cellules souches ont le potentiel remarquable pour développer dans de nombreux types cellulaires différents. Quand une cellule souche se divise, chaque nouvelle cellule a le potentiel de demeurer une cellule souche ou devenir un autre type de cellule avec une fonction plus spécialisée, ce prometteur de la science est à la tête des scientifiques pour étudier la possibilité de thérapies cellulaires pour traiter la maladie. Lorsque la culture en suspension sans facteurs antidifferentiation, les cellules souches embryonnaires spontanément différencier et former en trois dimensions des agrégats multicellulaires. Ces agrégats cellulaires sont appelés corps embryoïdes (EB). Culture en suspension de chute est une méthode largement utilisée EB formation de l&#39;induction. Le fond arrondi de la goutte suspendue permet l&#39;agrégation des cellules ES qui peuvent fournir des cellules MES un bon environnement pour former EBS. Le nombre de cellules ES aggregatied dans une goutte suspendue peut être contrôlée en faisant varier le nombre de cellules dans la suspension cellulaire initiale à être accroché comme une goutte sur le couvercle de la boîte de Pétri. En utilisant cette méthode, nous pouvons reproductible forme homogène EB à partir d&#39;un nombre prédéterminé de cellules ES.

Cette vidéo montre comment effectuer la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris aux corps embryoïdes utilisant la méthode de la goutte pendante.

Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Les cellules souches possèdent le potentiel remarquable de se développer en de nombreux types cellulaires différents. Lorsqu'une cellule souche se divise, chaque nouvelle cellule a le potentiel soit de...

Les cellules souches ont la capacité remarquable de se différencier en de nombreux types cellulaires différents dans l'organisme. Elles jouent un rôle de système de réparation pour le corps. Elles peuvent théoriquement se diviser sans limite afin de renouveler d'autres cellules.Lorsqu'une cellule souche se divise, chaque nouvelle cellule a la capacité de rester une cellule souche ou de devenir un autre type de cellule doté d'une fonction plus spécialisée. Ce domaine de recherche prometteur pousse les scientifiques à explorer la possibilité de thérapies cellulaires pour traiter des maladies in vitro. La différenciation des cellules souches embryonnaires se produit lorsque les cellules sont autorisées à s'agréger en culture en suspension.En l'absence d'embryons de souris, de fibroblastes nourriciers et de facteur inhibiteur de la leucémie, ces agrégats cellulaires sont appelés corps embryonnaires. La méthode de la goutte suspendue est une procédure efficace pour la différenciation des cellules souches en corps embryonnaires in vitro. Bonjour, je suis Sha Juan du laboratoire de Lefty dans la division de médecine cardiovasculaire de l'Université Stanford.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant la différenciation individuelle de cellules souches embryonnaires en embryons corporels selon la méthode du goutte-à-goutte manuel. Nous utilisons généralement cette méthode pour différencier les cellules souches embryonnaires en cardiomyocytes. Cette procédure comprend les étapes suivantes : préparer une suspension monocellulaire de cellules souches embryonnaires, générer des cultures en gouttes manuelles, transférer les cultures en gouttes manuelles vers des plaques à adhérence ultra faible, puis ensemencer les embryons corporels sur des plaques revêtues de gelée de jus.Très bien, commençons. La première étape de la procédure consiste à préparer une suspension monocellulaire de cellules souches embryonnaires. Étant donné que nous cultivons nos cellules souches embryonnaires non différenciées en les faisant croître sur des fibroblastes embryonnaires de souris, nous devons détacher les cellules et les séparer des fibroblastes.Pour ce faire, nous réalisons une trypsination des cellules en utilisant des procédures standard. Une fois le traitement à la trypsine terminé, ajoutez du milieu pour cellules souches embryonnaires de souris afin de neutraliser la trypsine. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.Ensuite, dispersez les colonies cellulaires en pipetant plusieurs fois vers le fond du tube jusqu'à l'obtention d'une suspension fine de cellules sans agrégats visibles. Centrifugez maintenant les cellules à 1 000 tr/min pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 10 mL de milieu pour cellules souches embryonnaires de souris.Transférez la suspension cellulaire dans un flacon T 75 préalablement recouvert de gélatine à 0,1 % et incubez à 37 degrés avec 5 % de CO2 pendant une heure. Après une heure, les fibroblastes se sont fixés au plateau, mais les cellules souches restent dans le milieu. Prélevez le milieu à l’aide d’une pipette pour récupérer les cellules souches.Faire centrifuger les cellules à mille tr/min pendant cinq minutes et aspirer le milieu. Ensuite, ajouter 10 mL supplémentaires de milieu de différenciation, puis resuspendre les cellules par pipetage répété jusqu’à l’obtention d’une suspension fine de cellules. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Nous sommes maintenant prêts à cultiver la suspension cellulaire selon la méthode de la goutte pendante. Pour commencer la culture en goutte pendante, utilisez le milieu de différenciation afin de diluer la suspension de cellules souches à une concentration de 500 cellules par 20 microlitres. Ensuite, retournez le couvercle d'une plaque de culture tissulaire de 150 millimètres.Ensuite, pipetez 20 microlitres de la suspension cellulaire sur la surface interne du couvercle de la plaque. À l'aide d'une pipette multicanal, ajoutez 10 mils de PBS sur la plaque. Retournez rapidement le couvercle de la plaque et placez-le délicatement sur la plaque afin de former les gouttes suspendues.Une fois le couvercle de la plaque en place, transférez délicatement la plaque dans l'incubateur pour la culture. Laissez les cellules au repos pendant deux jours. Une fois l'incubation terminée, nous passerons au transfert de la culture en goutte pendante dans des plaques à adhérence ultra faible.Après deux jours, retournez soigneusement le couvercle de la plaque, puis aspirez 180 microlitres de milieu de différenciation frais et déposez plusieurs gouttes dans une plaque de 96 puits à adhérence ultra faible. Ensuite, prélevez les gouttes à l’aide d’une pipette et transférez-les une par une dans la plaque de 96 puits. Placez les plaques dans l’incubateur sans les perturber pendant trois jours.Les embryons continueront à croître en formant une structure sphérique. Une fois l'incubation terminée, nous serons prêts à ensemencer les embryons. Afin de favoriser la poursuite de leur différenciation.Nous les transférons dans une plaque de 48 puits revêtue de gélatine. Pour ce faire, nous recouvrons d'abord chaque puits de la plaque avec 300 microlitres de gélatine à 0,1 %. Après l'ajout de la gélatine, incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, aspirez la gélatine de la plaque à 48 puits. Ajoutez ensuite 300 microlitres de milieu de différenciation à chacun. Transférez maintenant un par un les embryons sphéroïdes de la plaque à 96 puits vers les plaques à 48 puits revêtues de gélatine.Nous changeons généralement le milieu le lendemain, puis tous les deux jours afin de maintenir les cellules. Nous utilisons cette méthode pour rechercher de meilleurs protocoles de différenciation des cellules souches embryonnaires. Dans les cardiomyocytes, nous venons de vous montrer comment réaliser une différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris par cultures en goutte suspendue.Cette méthode est efficace parce que le fond arrondi de la goutte suspendue permet l'agrégation des cellules souches embryonnaires, créant ainsi un bon environnement pour la formation des corps embryonnaires. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le nombre de cellules souches embryonnaires agrégées dans une goutte suspendue peut être contrôlé en faisant varier le nombre de cellules dans la suspension cellulaire initiale. Voilà tout.Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience.

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Biologie

Ce protocole décrit la dérivation de cellules souches hématopoïétiques transplantables à partir des cellules souches embryonnaires de souris (CES) et leur injection ultérieure dans des souris irradiées de façon létale bénéficiaires. Brièvement, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes, qui sont ensuite infectées par HOXB4 rétroviraux et co-cultivées avec des cellules stromales et OP9 cytokines hématopoïétiques.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

Nous montrons une méthode simple et rapide à charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes.

Shrinky-gouttes pendantes Dink: une façon simple de formulaire et de la Culture corps embryoïdes

Nous décrivons l'utilisation d'un test sur des cellules de souris ES base pour identifier les fenêtres de temps critique pour Wnt / β-caténine et l'activation du signal BMP lors de l'induction cardiogénique. La méthode fournit une plate-forme standardisée qui quantifie l'efficacité fiable cardiogénique, et elle est applicable à l'étude de lignées cellulaires d'autres.

Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;induction cardiogénique

Nous avons développé un nouveau protocole pour améliorer l'efficacité de la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Les cellules ES différenciées acquis motoneurones dispose comme en témoigne l'expression de marqueurs neuronaux et des neurones moteurs en utilisant des techniques d'immunohistochimie.

Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

La vidéo démontre la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (CSEm) en corps embryoïdes (EB) par la méthode de la goutte suspendue. Lors de la suspension des CSEm dans des gouttes suspendues et de l’incubation, les cellules s’agrègent pour former des EB, qui sont ensuite différenciées en cellules progénitrices neuronales (NPC) à l’aide d’un milieu de différenciation complété par de l’acide rétinoïque (AR).

Génération de progéniteurs neuraux à partir de cellules souches embryonnaires de souris par la méthode de la goutte suspendue

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Technique de génération de cellules progénitrices neurales à partir de cellules souches embryonnaires de souris

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Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

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Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Découvrez la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris par la méthode de goutte suspendue. Cette technique permet la formation de corps embryonnaires pour la recherche en médecine régénérative.

Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

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