Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l'imagerie par résonance magnétique

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est devenue une modalité d’imagerie prédominante pour les cellules souches transplantées localisées et pour mieux comprendre le mécanisme de régénération. Ces études IRM utilisent généralement des nanoparticules d’oxyde de fer comme agent de contraste d’imagerie. Cependant, les particules de fer peuvent rester dans les tissus après la mort des cellules souches et peuvent être absorbées par les macrophages, ce qui entraîne des conditions sous-optimales pour le suivi des cellules transplantées viables.

Cette vidéo démontrera que le chlorure de manganèse est une alternative efficace. Le marquage au chlorure de manganèse offre plusieurs avantages par rapport au marquage à l’oxyde de fer. Par exemple, le manganèse donne un signal positif, tandis qu’un signal négatif est produit par des particules ioniques.

De plus, l’ion manganèse est connu pour pénétrer dans les cellules via des canaux calciques voltage-dépendants. Ainsi, son apparence en IRM indique viable par des cellules biologiquement actives. Bonjour, je suis une mère de collège du laboratoire de Philip Yang dans la division de médecine cardiovasculaire de l’Université de Stanford.

Aujourd’hui, je vais vous montrer comment marquer les cellules souches embryonnaires humaines avec du manganèse pour l’imagerie par résonance magnétique. Cette procédure comprend les étapes suivantes, le marquage des cellules souches embryonnaires humaines avec des agents de contraste, la réalisation d’une imagerie par résonance magnétique cellulaire in vitro et l’analyse des résultats de l’IRM. Alors commençons.

La première étape de la procédure d’étiquetage consiste à préparer des cellules souches embryonnaires humaines, qui ont été cultivées dans des conditions sans fœtus. Pour ce faire, essayez les cellules pendant cinq minutes, puis neutralisez la trypsine en ajoutant du milieu de culture. Ensuite, faites tourner les cellules en centrifugeant à 800 RRP M pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius.

Après que Resus ait suspendu la palette cellulaire dans PBS, comptez le nombre de cellules par trip et coloration bleue en fonction du nombre de cellules obtenues, divisez les cellules en le nombre requis de quats dans des tubes coniques. Dans ce cas, je divise les cellules en quatre T de 3 millions de cellules. Palate à nouveau la cellule par centrifugation juste avant de commencer le marquage au manganèse, dissoudre le chlorure de manganèse frais dans du chlorure de sodium à 0,9 % pour former une solution de chlorure de manganèse de 0,1 millimolaire.

Afin d’observer l’activité des canaux calciques, nous avons préparé des échantillons. Le premier échantillon est notre contrôle, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium à 0,9 % seulement. Le deuxième échantillon contient des cellules incubées dans du chlorure de manganèse de 0,1 millimolaire, les échantillons trois et quatre contiennent des cellules incubées dans du chlorure de manganèse de 0,1 millimolaire avec soit cinq micromolaires de l’agoniste des canaux calciques AK 8, 6, 44, soit 250 micromolaires de l’antagoniste des canaux calciques.

Le péril ensuite : incuber les quatre échantillons à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 30 minutes Après 30 minutes, faites tourner les cellules à 800 tr/min pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, aspirez l’agent supan et lavez les cellules marquées deux fois avec du PBS. Après le lavage, suspendez chaque palette avec 200 microlitres de PBS et transférez-la dans des tubes PCR.

Ces palettes sont généralement blanches. D’accord, nous avons terminé de préparer les cellules marquées au manganèse à des fins de comparaison. Nous préparerons également des cellules en utilisant les méthodes plus traditionnelles de marquage du fer pour commencer le marquage du fer.

Le sulfate de protamine de qualité clinique de Nick avec de l’eau distillée pour obtenir une solution mère d’un milligramme par millilitre. Ensuite, dans le tube contenant le milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines, ajoutez du film d’oxyde à cent microgrammes par millilitre combiné avec du sulfate de protamine à 12 microgrammes par millilitre. Mélangez ensuite la solution pendant cinq minutes.

Après avoir mélangé la solution, ajoutez-la à vos cellules en utilisant un volume égal de la solution mélangée et du milieu de culture cellulaire pour obtenir une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre d’oxyde et de six microgrammes par millilitre de sulfate de protamine. Incuber les cellules pendant 12 heures après 12 heures, laver les cellules deux fois avec du PBS, le dernier lavage contenant 10 unités par millilitre d’héparine pour dissoudre le complexe de sulfate de protéine d’oxyde extracellulaire. Après avoir lavé les cellules de trypsine pour obtenir une suspension unicellulaire, comptez les cellules et le qua dans le nombre requis d’échantillons.

Dans ce cas, je prépare un échantillon avec 1 million de cellules et l’autre avec 3 millions de cellules. Cellules P suivantes, ces palettes doivent être creusées de couleur orange, brune. Enfin, nous suspendons chaque palette avec 200 myta de PBS et les transférons dans des tubes PCL.

D’accord, nous avons terminé l’étiquetage des cellules. Passons à l’imagerie IRM cellulaire. Pour commencer l’imagerie, nous fabriquons d’abord un fantôme afin de stabiliser les tubes contenant les palettes cellulaires et aussi d’éviter les artefacts de l’air ambiant pendant le balayage.

Pour ce faire, mélangez 1 % de sulfate de cuivre et 0,8 % d’agar dans de l’eau distillée et portez-le à ébullition au micro-ondes pendant cinq à sept minutes. Ce mélange est ensuite refroidi pendant au moins une heure pour obtenir un gel. Ensuite, les tubes contenant les pastilles de la cellule de marquage sont placés dans le fantôme pour le balayage.

L’IRM cellulaire in vitro est réalisée à l’aide d’un scanner 3,0 T à l’aide d’une bobine de genou clinique. Nous utilisons le Signa fabriqué par GE Medical Systems pour scanner les cellules marquées au manganèse pour chacun des quatre échantillons à l’aide d’une séquence d’écho de spin. Les paramètres de la séquence ont été élaborés à partir de la cartographie T précédemment étudiée des cellules marquées.

Nous utilisons le temps d’écho au minimum, un temps de répétition de 800 millisecondes, un champ de vision de 12 x 12 centimètres, une matrice 2 56 x 2 56. Prochain. Ensuite, balayez les cellules marquées au fer à l’aide d’une séquence d’écho de gradient

Nous utilisons les paramètres suivants pour cette imagerie. Temps d’écho de 10 millisecondes, temps de répétition de cent millisecondes. Angle de retournement de 30 degrés, champ de vision de 12 x 12 centimètres matrice 2 56 x 2 56 et le suivant.

D’accord, nous en avons tous fini avec l’imagerie. Jetons maintenant un coup d’œil aux résultats. Voici les résultats de l’IRM de quatre échantillons différents de cellules marquées au manganèse.

L’échantillon numéro un est notre contrôle, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium à 0,9 % seulement. L’échantillon numéro deux contient des cellules incubées dans du chlorure de manganèse de 0,1 millimolaire. L’échantillon numéro trois contient des cellules incubées dans du chlorure de manganèse de 0,1 millimolaire avec cinq micro de l’agoniste des canaux calciques vacay 8 6 4 4.

L’échantillon numéro quatre contient des cellules incubées dans 0,1 million de chlorure de manganèse MO avec 250 micro moura du voile antagoniste des canaux calciques. Par rapport aux cellules marquées avec du manganèse seul, l’intensité du signal augmente en présence de l’agoniste des canaux calciques et diminue en présence d’un antagoniste des canaux calciques. La zone d’augmentation du signal pour les cellules marquées au manganèse est mesurée à l’aide de l’image J.Ces résultats indiquent que le manganèse entre par le canal calcique voltage-dépendant.

Comparons maintenant ces résultats avec les résultats des cellules marquées au fer. Notez la différence entre le signal positif brillant des cellules marquées au manganèse et le signal négatif sombre des cellules marquées au fer. Nous venons de vous montrer comment effectuer le marquage au manganèse de cellules souches embryonnaires humaines pour l’imagerie par résonance magnétique cellulaire in vitro.

Cette procédure est une méthode efficace pour suivre les cellules souches, car un manganèse peut être facilement introduit dans les cellules via une simple incubation de 30 minutes. Deux cellules marquées au manganèse fournissent des images claires avec un signal positif et trois cellules de manganèse pénètrent dans les cellules via le canal calcique voltage-dépendant, comme le montre l’utilisation d’agonistes et d’antagonistes des canaux calciques, et ne pénètrent donc que dans les cellules viables. Par conséquent, nous pensons que le marquage au manganèse des cellules souches embryonnaires humaines a un grand potentiel pour une IRM cellulaire in vivo précise pour suivre l’effet des cellules souches embryonnaires humaines transplantées dans les zones blessées ischémiques.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.