Name: Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour limagerie par résonance magnétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Découvrez le marquage des cellules souches embryonnaires humaines avec du chlorure de manganèse pour l'IRM. Cette méthode offre un signal positif et permet de suivre uniquement les cellules viables via les canaux calciques.

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Étiquetage de manganèse de cellules souches embryonnaires humaines <ol><li> Trypsiniser les tiges embryonnaires humaines qui ont été cultivées dans des conditions exemptes d&#39;alimentation pendant 5 minutes. Neutraliser la trypsine en ajoutant des milieux de culture. </li><li> Isoler les cellules par centrifugation à 800 rpm pendant 5 minutes à 20 ° Celsius. Après remise en suspension du culot cellulaire, compter le nombre de cellules par coloration au bleu trypan. Basé sur le nombre de cellules obtenues, diviser les cellules en quatre parties aliquotes de 3 millions de cellules dans des tubes coniques. Pellet nouveau les cellules par centrifugation. </li><li> Juste avant de commencer l&#39;étiquetage de manganèse, de dissoudre le chlorure de manganèse fraîche avec une solution de chlorure de sodium 0,9% pour faire une solution de chlorure de 0,1 mM de manganèse. </li><li> Afin d&#39;observer l&#39;activité des canaux calciques, quatre échantillons ont été préparés. Le premier échantillon est de notre contrôle, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium 0,9% seulement. Le deuxième échantillon contient des cellules incubées dans 0,1 mM de MnCl2. Exemple 3 et 4 contiennent des cellules incubées dans 0,1 mM de 2 MnCl soit avec 5 uM de Ca 2 +-canal agoniste (s )-(-)- Bay K8644, ou 250 M de Ca 2 +-canal antagoniste, le vérapamil. Incuber les quatre échantillons à 37 ° Celsius avec 5% de CO 2 pendant 30 minutes. </li><li> Après 30 minutes, ralentit les cellules à 800 rpm pendant 5 minutes à 20 ° Celsius. Puis aspirer le surnageant et laver les cellules marquées à deux reprises avec du PBS. Après le lavage, remettre en suspension chaque culot avec 200 ul de PBS et le transfert dans des tubes PCR. Ces pastilles sont généralement blanches. </li></ol> Etiquetage Fer de cellules souches embryonnaires humaines <ol><li> Mix de qualité clinique du sulfate de protamine à l&#39;eau distillée pour obtenir une solution à 1 mg / ml. </li><li> Dans un tube contenant embryonnaires humaines supports de culture de cellules souches, ajouter ferumoxides à 100 pg / mL suivie par l&#39;addition de 12 pg / ml de sulfate de protamine. Mélanger la solution vigoureusement pendant cinq minutes. </li><li> Ajouter solution mixte d&#39;un montant égal du milieu de culture cellulaire pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml de ferumoxides et 6 pg / ml de sulfate de protamine l&#39;étiquette pour les cellules. Incuber les cellules dans cette solution pendant 12 heures. </li><li> Laver les cellules deux fois avec PBS, avec le dernier lavage contenant de l&#39;héparine 10U/ml de dissoudre le complexe de sulfate extracellulaire ferumoxides-protamine. Après lavage, les cellules trypsiniser pour obtenir une suspension cellulaire unique. </li><li> Compter les cellules et dans la partie aliquote nombre requis d&#39;échantillons. Après le lavage, remettre en suspension chaque culot avec 200 ul de PBS et le transfert dans des tubes PCR. Ces pastilles doivent être orange foncé de couleur marron. </li></ol> Exécution Cellulaire Imagerie par Résonance Magnétique <ol><li> Faire un fantôme afin de stabiliser les tubes contenant les pastilles de cellules et aussi pour éviter des artefacts de l&#39;air ambiant lors de la numérisation. Pour ce faire, mélangez 0,8% d&#39;agar-agar et 1% de sulfate de cuivre dans l&#39;eau distillée et porter à ébullition par des micro-ondes pendant 5-7 minutes. Refroidir le mélange pendant au moins 1 heure avant de la numérisation pour atteindre un gel. </li><li> Les tubes contenant les pastilles de cellules étiquetées sont placées dans le fantôme pour la numérisation. Cellulaire in vitro IRM est réalisée à Signa HDx IRM 3T (GE Medical Systems) en utilisant la bobine au genou clinique. </li><li> Balayage des cellules de manganèse étiquetés pour chacun des trois échantillons en utilisant une séquence d&#39;écho de spin: TR, temps de répétition = 800 ms. TE, le temps d&#39;écho = minimum, FOV; champ de vision = 12 x 12 cm; matrice = 256x256, 1 NEX. </li><li> Balayage des cellules fer marqué en utilisant une séquence d&#39;écho de gradient. Nous utilisons les paramètres suivants pour cette imagerie: TR = 100 ms; TE = 10 ms, FA; angle de bascule = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matrice = 256 x 256, 1 NEX. </li></ol> Analyser les résultats de l&#39;IRM <ol><li> Analyser des images de l&#39;IRM à partir de 4 échantillons différents de cellules de manganèse-étiqueté: <ul><li> Exemple # 1 est de notre contrôle, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium 0,9% seulement. </li><li> Exemple n ° 2 contient des cellules incubées dans 0,1 mM de MnCl2. </li><li> Exemple n ° 3 contient des cellules incubées dans 0,1 mM de 2 à 5 uM MnCl de Ca 2 +-canal agoniste (s )-(-)- Bay K8644. </li><li> Exemple n ° 4 contient des cellules incubées dans 0,1 mM de 2 MnCl avec 250 uM de Ca 2 +-canal antagoniste, le vérapamil. </li></ul></li><li> Comme prévu, les différences dans l&#39;intensité du signal du manganèse cellules marquées sont visibles. Comparé aux cellules marquées purement avec le manganèse, l&#39;intensité du signal augmente nettement dans la présence de l&#39;agoniste des canaux calciques et diminue en présence d&#39;un antagoniste des canaux calciques. La zone où l&#39;intensité du signal a augmenté pour le manganèse cellules marquées sont mesurés en utilisant Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Le même logiciel est utilisé pour analyser la zone d&#39;obscurité hors résonance du signal à partir du fer cellules marquées. La taille du signal sombres du fer cellules marquées dépend du nombre de cellules ou le nombre de particules de fer contenue par les cellules. Dans ce cas,, Un million de cellules montre une zone plus petite des signaux sombres par rapport au signal des trois millions de cellules. </li></ol>

<ol><li>Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-calcium+interactions+with+contrast+media+for+cardiac+magnetic+resonance+imaging%3A+a+study+of+manganese+chloride+supplemented+with+calcium+gluconate+in+isolated+Guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts.</a> Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).</li>
<li>Aoki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+for+magnetic+resonance+imaging+with+the+T1+agent+manganese+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride.</a> NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li>
<li>Arbab, A. S., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MRI+and+its+role+in+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular MRI and its role in stem cell therapy.</a> Regen Med. 3, 199-215 (2008).</li>
</ol>

Ces résultats indiquent que le manganèse ne pénètrent par le canal calcique voltage-dépendants, et le manganèse peut être utilisé comme agent de contraste IRM, qui peut également montrer la viabilité cellulaire. Par conséquent, nous suggérons que le manganèse-guidée par IRM peut être utile de surveiller la viabilité des cellules après la transplantation de cellules souches embryonnaires humaines dans le myocarde.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de manganèse tétrahydraté</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>(S)-(-)-Bay K8644 </td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B133</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de (+)-vérapamil, titrage minimal de 99,0 %</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium 0,85-0,90 % p/v</td><td>Réactif</td><td>VWR international</td><td>VW 3257-1</td><td></td></tr><tr><td>Feridex I.V.</td><td>Réactif</td><td>Berlex Laboratories</td><td>NDC 59338-7035-5</td><td>solution injectable de ferumoxides 11,2 mg fer/mL</td></tr><tr><td>Sulfate de protamine</td><td>Réactif</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td>NDC 63323-229-05</td><td>50 mg (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Knockout SR (substitut de sérum pour cellules ES)</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>2- mercapt&amp;#8211;thanol 98+%</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 3148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM 100x</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine 10 000 unités/mL</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution 100x d'acides aminés non essentiels MEM</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>IRM Signa HDx 3T</td><td>Outil</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bobine clinique pour genou</td><td>Outil</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr></tbody></table>

marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont démontré la capacité de restaurer les blessés du myocarde. Imagerie par résonance magnétique (IRM) a émergé comme l&#39;une des modalités d&#39;imagerie prédominante pour évaluer la restauration de la blessés myocarde. Par ailleurs, des agents de marquage ex vivo, tels que l&#39;oxyde de fer nanoparticules, ont été employés pour suivre et localiser les cellules souches transplantées. Cependant, cette méthode ne permet pas de surveiller une propriété fondamentale de biologie cellulaire quant à la viabilité des cellules transplantées. Il est connu que le chlorure de manganèse (MnCl2) pénètre dans les cellules via voltage-dépendants du calcium (Ca 2 +) des canaux lorsque les cellules sont biologiquement actifs, et s&#39;accumule intracellulairement pour générer l&#39;effet T shortening 1. Par conséquent, nous suggérons que le manganèse-guidée par IRM peut être utile de surveiller la viabilité des cellules après la transplantation de CSEh dans le myocarde. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment étiqueter CSEh avec MnCl2 et comment ces cellules peuvent être clairement vus en utilisant l&#39;IRM in vitro. Dans le même temps, l&#39;activité biologique de Ca 2 +-canaux seront modulées utilisant à la fois de Ca 2 +-canal agonistes et antagonistes pour évaluer les changements du signal concomitant.

Dans cette vidéo, nous montrons comment étiqueter cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec du chlorure de manganèse (MnCl<sub&gt; 2</sub&gt;), Qui peuvent pénétrer dans les cellules via les canaux calciques voltage-dépendants lorsque les cellules sont biologiquement actives. De plus, nous montrons l&#39;utilisation de MnCl<sub&gt; 2</sub&gt; Comme agent de contraste IRM cellulaire pour déterminer la viabilité in vitro des CSEh.

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) ont démontré leur capacité à restaurer le myocarde lésé. L'imagerie par résonance magnétique (IRM) s'est imposée comme l'une des...

L'imagerie par résonance magnétique, ou IRM, s'est imposée comme une modalité d'imagerie prédominante pour localiser les cellules souches transplantées et mieux comprendre le mécanisme de régénération. Ces études par IRM utilisent généralement des nanoparticules d'oxyde de fer comme agent de contraste. Toutefois, les particules de fer peuvent persister dans les tissus après la mort des cellules souches et peuvent être captées par les macrophages, créant ainsi des conditions sous-optimales pour le suivi des cellules transplantées viables.Cette vidéo démontrera que le chlorure de manganèse constitue une alternative efficace. Le marquage par agent de contraste au chlorure de manganèse présente plusieurs avantages par rapport au marquage à l'oxyde de fer. Par exemple, le manganèse produit un signal positif, alors que les particules de fer génèrent un signal négatif.En outre, l'ion manganèse est connu pour pénétrer dans les cellules par des canaux calciques activés par le voltage. Son apparition en IRM indique donc la présence de cellules viables et biologiquement actives. Bonjour, je suis Uni Mother du laboratoire de Philip Yang, au sein de la division de médecine cardiovasculaire de l'université Stanford.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment marquer des cellules souches embryonnaires humaines au manganèse pour l'imagerie par résonance magnétique. Cette procédure comprend les étapes suivantes : marquage des cellules souches embryonnaires humaines avec des agents de contraste, réalisation d'une imagerie par résonance magnétique cellulaire in vitro et analyse des résultats d'IRM. Commençons donc.La première étape de la procédure de marquage consiste à préparer des cellules souches embryonnaires humaines, cultivées dans des conditions sans sérum fœtal. Pour ce faire, soumettez les cellules à une action de la trypsine pendant cinq minutes, puis neutralisez la trypsine en ajoutant du milieu de culture. Ensuite, centrifugez les cellules à 800 RRP M pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius.Après avoir resuspendu la palette de cellules dans du PBS, déterminez le nombre de cellules par triplicata à l’aide de la coloration au bleu de trypan, puis, en fonction du décompte obtenu, répartissez les cellules en aliquots dans des tubes coniques selon le nombre requis. Dans ce cas, je répartis les cellules en quatre aliquots de 3 millions de cellules chacun. Pelletez à nouveau les cellules par centrifugation juste avant de commencer le marquage au manganèse. Dissolvez du chlorure de manganèse fraîchement préparé dans du chlorure de sodium à 0,9 % afin d’obtenir une solution de chlorure de manganèse à 0,1 millimolaire.Afin d'observer l'activité des canaux calciques, nous avons préparé des échantillons. Le premier échantillon est notre témoin, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium à 0,9 % seul. Le deuxième échantillon contient des cellules incubées dans du chlorure de manganèse à 0,1 millimolaire ; les échantillons trois et quatre contiennent des cellules incubées dans du chlorure de manganèse à 0,1 millimolaire avec respectivement cinq micromoles de l'agoniste des canaux calciques AK 8 6 44 ou 250 micromoles de l'antagoniste des canaux calciques.Ensuite, incuber les quatre échantillons à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2 pendant 30 minutes. Après 30 minutes, centrifuger les cellules à 800 tr/min pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Puis aspirer le surnageant et laver les cellules marquées deux fois avec du PBS. Après le lavage, resuspendre chaque culot dans 200 microlitres de PBS et transférer dans des tubes PCR.Ces pastilles sont généralement blanches. Très bien, nous avons terminé la préparation des cellules marquées au manganèse à des fins de comparaison. Nous préparerons également des cellules en utilisant les méthodes de marquage au fer plus traditionnelles afin de commencer le marquage au fer.Préparez une solution mère de sulfate de protamine de qualité clinique à un milligramme par millilitre en la diluant avec de l'eau distillée. Ensuite, dans le tube contenant le milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines, ajoutez de l'oxyde de film à une concentration de cent microgrammes par millilitre, combiné au sulfate de protamine à 12 microgrammes par millilitre. Mélangez ensuite la solution pendant cinq minutes.Après avoir mélangé la solution, ajoutez-la à vos cellules en utilisant un volume égal de la solution mélangée et du milieu de culture cellulaire afin d'obtenir une concentration finale de 50 microgramme par millilitre d'oxyde et de six microgrammes par millilitre de sulfate de protamine. Incubez les cellules pendant 12 heures, puis après 12 heures, lavez les cellules deux fois avec du PBS, le dernier lavage contenant 10 unité par millilitre d'héparine afin de dissoudre le complexe extracellulaire d'oxyde et de sulfate de protéine. Après le lavage, trypsinez les cellules pour obtenir une suspension monocellulaire, puis comptez les cellules et répartissez-les en fonction du nombre requis d'échantillons.Dans ce cas, je prépare un échantillon avec 1 million de cellules et un autre avec 3 millions de cellules. Ensuite, concernant les cellules P, ces pastilles doivent présenter une couleur orange brunâtre. Enfin, nous resuspendons chaque pastille dans 200 µL de PBS et les transférons dans des tubes PCL.Très bien, nous avons terminé le marquage des cellules. Passons maintenant à l'imagerie RM cellulaire. Pour commencer l'imagerie, nous fabriquons tout d'abord un fantôme afin de stabiliser les tubes contenant les pastilles cellulaires et d'éviter également les artefacts provenant de l'air environnant pendant le balayage.Pour ce faire, mélanger 1 % de sulfate de cuivre et 0,8 % d'agar dans de l'eau distillée et porter à ébullition au micro-ondes pendant cinq à sept minutes. Ce mélange est ensuite refroidi pendant au moins une heure afin d'obtenir un gel. Ensuite, les tubes contenant les pastilles de cellules marquées sont placés dans le fantôme pour l'analyse par imagerie.L'IRM cellulaire in vitro est réalisée à l'aide d'un scanner 3,0 T équipé d'une bobine clinique pour genou. Nous utilisons le Signa fabriqué par GE Medical Systems pour scanner les cellules marquées au manganèse pour chacun des quatre échantillons, en utilisant une séquence écho de spin. Les paramètres de la séquence ont été déterminés à partir de cartographies T précédemment étudiées sur les cellules marquées.Nous utilisons un temps d'écho au minimum un temps de répétition de 800 millisecondes, un champ de vision de 12 sur 12 centimètres et une matrice de 256 par 256. Suivant. Ensuite, balayer les cellules marquées au fer à l'aide d'une séquence d'écho de gradient.Nous utilisons les paramètres suivants pour cet examen d'imagerie. Un temps d'écho de 10 millisecondes, un temps de répétition de cent millisecondes. Un angle de bascule de 30 degrés, un champ de vision de 12 par 12 centimètres, une matrice de 256 par 256 et le suivant.D'accord, nous avons terminé l'imagerie. Examinons maintenant les résultats. Voici les résultats de l'IRM pour quatre échantillons différents de cellules marquées au manganèse.L'échantillon numéro un est notre témoin, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium à 0,9 % uniquement. L'échantillon numéro deux contient des cellules incubées dans du chlorure de manganèse à 0,1 millimolaire. L'échantillon numéro trois contient des cellules incubées dans du chlorure de manganèse à 0,1 millimolaire avec cinq microgrammes de l'agoniste des canaux calciques vacay 8 6 4 4.L'échantillon numéro quatre contient des cellules incubées dans 0,1 million MO de chlorure de manganèse avec 250 micro moura de l'antagoniste des canaux calciques veil. Par rapport aux cellules marquées au manganèse seul, l'intensité du signal augmente en présence de l'agoniste des canaux calciques et diminue en présence de l'antagoniste des canaux calciques. La zone d'augmentation du signal pour les cellules marquées au manganèse est mesurée à l'aide d'Image J. Ces résultats indiquent que le manganèse pénètre effectivement par l'intermédiaire du canal calcique sensible à la tension.Comparons maintenant ces résultats à ceux des cellules marquées au fer. Notez la différence entre le signal positif brillant des cellules marquées au manganèse et le signal négatif sombre des cellules marquées au fer. Nous venons de vous montrer comment réaliser un marquage au manganèse de cellules souches embryonnaires humaines pour l'imagerie par résonance magnétique cellulaire in vitro.Cette procédure constitue une méthode efficace pour suivre les cellules souches, car un manganèse peut être facilement introduit dans les cellules grâce à une simple incubation de 30 minutes. Deuxièmement, les cellules marquées au manganèse fournissent des images nettes avec un signal positif, et troisièmement, le manganèse pénètre dans les cellules via le canal calcique sensible à la tension, comme le montre l'utilisation d'agonistes et d'antagonistes des canaux calciques, et pénètre donc uniquement dans les cellules viables. Par conséquent, nous pensons que le marquage au manganèse des cellules souches embryonnaires humaines présente un grand potentiel pour une imagerie par résonance magnétique cellulaire in vivo précise, permettant de suivre l'effet des cellules souches embryonnaires humaines transplantées dans les zones lésées par ischémie.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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