Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Sea elegance est un organisme modèle incroyablement utile en raison de notre connaissance de ses lignées cellulaires et de la richesse des informations produites par le séquençage et l’analyse de l’ensemble de son génome. Dans cette vidéo, nous démontrons le processus de micro-injection de plasmides dans l’élégance marine et la sélection de la progéniture transgénique à l’aide de la microscopie fluorescente en tant qu’animal transparent et multicellulaire, l’élégance marine est idéale pour visualiser les transgènes exprimant des protéines marquées par fluorescence in vivo. Bonjour, je m’appelle Laura Berkowitz et je suis associée de recherche au laboratoire Caldwell du département des sciences biologiques de l’Université de l’Alabama.

Et je m’appelle Adam Knight, également du Calwell Lab de l’Université de l’Alabama. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment vous préparer et effectuer la micro-injection de plasmine pour générer une élégance de mer transgénique, et je vais vous montrer comment sélectionner et entretenir des lignes d’élégance de phoque transgénique. Alors commençons.

Avant de commencer la micro-injection, nous avons quelques étapes de préparation, que je vais vous montrer maintenant. Tout d’abord, préparez l’ADN plasmidique à injecter, deux plasmides sont nécessaires, l’un qui code l’expression tissulaire spécifique de notre gène d’intérêt, et le second qui fournit un marqueur de transformation sélectionnable. Mélangez les plasmides dans un rapport de 50 nanogrammes par microlitre.

Chaque fois suivant, préparez des coussinets de tarière, qui seront utilisés pour immobiliser les vers pour l’injection. Pour fabriquer les coussinets de tarière, disposez d’abord plusieurs verres de couverture de 22 x 50 millimètres sur la paillasse. À l’aide d’une pipette de pâturage, placez une goutte de 2 %agros fondu sur un verre de couverture, et placez immédiatement un deuxième verre de couverture sur la goutte à un angle de 90 degrés par rapport à la première.

Laissez l’aéro se solidifier pendant quelques secondes, puis retirez la vitre du couvercle supérieur. Le diamètre du disque aplati de l’aéro doit être compris entre 15 et 20 millimètres. Comme un animal de compagnie, laissez le coussin sécher complètement à l’air libre pendant plusieurs heures ou toute la nuit.

Une fois qu’ils sont secs, conservez les tampons dans une boîte en verre de protection à température ambiante. Ensuite, préparez les chargeurs d’aiguilles pour la solution d’ADN. Pour ce faire, prenez un tube capillaire de cent microlitres et chauffez-le au milieu d’une flamme nue et tirez-le rapidement à environ deux fois sa longueur.

Une fois le tube capillaire refroidi, séparez les deux moitiés. Stockez 10 à 20 chargeurs d’aiguilles pour l’injection. Vous pouvez les stocker à la verticale dans un micro tube à centrifuger.

Brack, fais attention. Les points de chargement d’aiguilles sont très tranchants. Fabriquez maintenant les aiguilles de micro-injection.

Ces aiguilles sont fabriquées à partir d’un tube capillaire spécial qui contient un filament de verre interne. Ce filament sert de mèche pour la solution d’ADN. Pour fabriquer les aiguilles, nous utilisons un Niki PP eight 30 Polar Avec un réglage de chaleur de 24,8, plusieurs aiguilles sont tirées à la fois pour le stockage.

Plusieurs aiguilles peuvent être montées sur une bande de pâte à modeler. De petits éclats de verre de protection seront utilisés pour ouvrir la pointe de l’aiguille tirée. Ces éclats sont préparés en enveloppant un verre de couverture de 18 x 18 millimètres dans une lingette Kim et en appliquant doucement une pression jusqu’à ce qu’il se brise en plusieurs morceaux.

Utilisez des partitions d’environ trois millimètres sur quatre. En plus de préparer l’ADN et les aiguilles, préparez environ 50 à 100 correctement préparés. Deux vers de type sauvage pour chaque construction de vecteur d’expression à injecter.

Nous sommes maintenant prêts à mettre en place le microscope à micro-injection. Pour commencer à installer le microscope, ouvrez la valve principale du réservoir d’hélium qui est reliée au bras de l’aiguille de micro-injection et au support. Fermez le régulateur pour permettre au gaz de pénétrer dans la conduite.

En portant la pression à 35 PSI, le gaz peut être libéré à l’aide d’une pédale. Ensuite, insérez un chargeur d’aiguille dans un tube de pipette à bouche standard et déposez une petite quantité du mélange plasmidique d’environ un microlitre. Maintenant, insérez doucement le chargeur tout au long de l’aiguille de micro-injection jusqu’à ce qu’une résistance se fasse sentir.

Expulsez la solution d’ADN en soufflant doucement, puis retirez le chargeur. Une fois l’ADN chargé, insérez l’aiguille dans le bras de micro-injection, en prenant soin de la placer dans le petit joint interne en caoutchouc, puis fixez-la au bras du manipulateur. Ensuite, placez un éclat de verre de couverture brise-aiguille sur un bord d’un tampon de tarière.

Couvrez l’éclat ainsi que toute la surface du tampon de tarière avec de l’huile de carbone sacrée. Placez ensuite le tampon de tarière sur la platine d’un microscope inversé. Une fois le tampon de tarière en place, positionnez l’aiguille au centre du champ de visualisation à l’aide de l’objectif Forex et de l’éclairage en champ clair, mais ne l’abaissez pas encore dans l’huile.

Positionnez ensuite le bord intérieur de l’éclat de verre de couverture au centre, puis concentrez-vous dessus. Abaissez l’aiguille dans l’huile, en l’amenant dans le même plan focal que l’éclat de verre de couverture. Augmentez le grossissement en passant sur l’objectif 40x, puis refaites la mise au point sur le bord de l’éclat et repositionnez la pointe de l’aiguille si nécessaire.

Ouvrez maintenant la pointe de l’aiguille d’injection. Poussez doucement l’aiguille contre le bord de l’éclat de verre de couverture, tout en appliquant une courte impulsion de gaz via la pédale. L’aiguille sera suffisamment ouverte.

Lorsque de petites gouttelettes de liquide s’échappent de l’extrémité de l’aiguille, un écoulement excessif de liquide en raison d’une trop grande ouverture n’est pas souhaitable car elle tuera les animaux. Une fois que l’aiguille est prête, nous commençons la micro-injection. Ensuite, retirez le tampon de la vis sans fin de la scène en soulevant l’aiguille.

Mais ne modifiez pas la position de l’axe X ou Y. Faites glisser la platine sous l’aiguille. Retirez le tampon de la tarière et placez-le sur un microscope à dissection.

Transférez un mot sur le tampon sous la surface de l’huile. Si le ver se tortille doucement jusqu’à ce qu’il entre en contact avec le tampon de la tarière, le ver humide doit adhérer à l’agro sec. Remettez rapidement le tampon de tarière sur la scène, en centrant la vis sans fin dans le champ de vision.

Abaissez ensuite l’aiguille dans le même plan de foyer que le ver. Basculez les filtres de la lunette inversée sur l’éclairage Hoffman. Ce filtre de contraste permet de voir les détails morphologiques du ver.

À l’aide de l’objectif 40x, concentrez-vous sur le centre sensoriel granuleux de la gonade du ver sous le motif en nid d’abeille des noyaux germinaux. Choisissez la gonade qui est positionnée sur le côté du ver face à l’aiguille. Bien. Réglez la position de l’aiguille jusqu’à ce que la pointe soit également nette.

Insérez doucement l’aiguille au centre de la gonade et appliquez une brève impulsion de pression de gaz pour expulser une gouttelette ou deux d’ADN dans le bras de la gonade. Vous devriez observer une vague de liquide se répandre sur l’aiguillon distal avec beaucoup de pratique et d’habileté. Vous pouvez frapper le centre d’aiguillon à chaque fois.

Gardez à l’esprit qu’il est important de travailler rapidement lors de l’injection d’un ver. Comme il peut facilement se dessécher. Idéalement, l’ensemble du processus devrait prendre moins d’une à deux minutes.

Une fois l’injection terminée, retirez le tampon de la tarière de la platine et placez-le sur une lunette de dissection. Appliquez un microlitre de tampon M nine directement sur le ver injecté. Cela peut impliquer d’immerger la pointe de la pipette sous la surface de l’huile halo carb.

Le tampon devrait réhydrater le ver et il flottera ensuite sur la surface du coussin aérodynamique, transférera le ver dans une plaque régulière à l’aide d’un pic à vers. Maintenant, je vais remettre les vers injectés à Adam et il nous montrera la sélection et l’entretien des lignées transgéniques. Les vers injectés sont transférés sur des plaques individuelles de 60 millimètres fraîchement ensemencées et laissés se reproduire.

Ces vers représentent la génération P zéro. Généralement, les animaux injectés sont incubés à 20 degrés Celsius pendant deux à trois jours jusqu’à l’apparition de la progéniture. Une fois que la progéniture apparaît, nous sommes prêts à commencer le dépistage des vers transgéniques.

La progéniture F1 est observée pour trouver des preuves du marqueur transgénique. Dans ce cas, le marqueur sélectionnable est fluorescent, ce qui permet de dépister à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent. Chaque animal porteur fluorescent F1 est cloné séparément sur une nouvelle plaque.

Le P zéro injecté ne peut produire qu’une à cinq progénitures fluorescentes parmi l’ensemble de ses F1. Laissez les hermaphrodites F1 se reproduire à 20 degrés pendant deux à trois jours jusqu’à l’apparition de la progéniture. Une fois que la génération F two est prête, on les observe également pour les animaux transgéniques. F deux animaux qui ont hérité et exprimé un marqueur transgénique sont considérés comme une lignée stable.

Chaque lignée stable indépendante doit être maintenue comme une lignée distincte de vers qui se propage chaque lignée en transférant plusieurs animaux transgéniques dans une nouvelle plaque à chaque génération. Cela doit être effectué à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent. Si le marqueur sélectionnable est fluorescent pour contrôler la variabilité du nombre de copies du gène, générer un minimum de trois lignées stables indépendantes par construction injectée.

Nous venons de vous montrer comment micro-injecter de l’expression, des constructions vectorielles, et voir elgan et pour sélectionner des lignes stables. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.