Name: Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Apprenez la microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des lignées transgéniques stables. Cette méthode permet de visualiser l'expression génique in vivo par fluorescence.

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Nous tenons à souligner l&#39;esprit de coopération de tous les membres du laboratoire Caldwell. Mouvements anormaux de recherche dans le laboratoire a été soutenu par la dystonie Bachmann-Strauss &amp; Parkinson Foundation, Royaume-Parkinson Foundation, American Association Maladie de Parkinson, la maladie de Parkinson Association de l&#39;Alabama, la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson, et une recherche de premier cycle.

Construction plasmide d&#39;expression Deux plasmides sont nécessaires: un pour expression tissu-spécifique du gène d&#39;intérêt et d&#39;une seconde comme marqueur de la transformation sélectionnable. Experimental plasmidique <ol><li> Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d&#39;intérêt, par exemple, un nerf ou de muscle promoteur spécifique. Si l&#39;on est d&#39;exprimer des gènes multiples dans le même tissu, une cassette promoteur plasmide dans le système Gateway (Invitrogen) peuvent être utilisés. Cette approche permet l&#39;insertion d&#39;un gène d&#39;intérêt en aval du promoteur par 4 le clonage par recombinaison. Généralement, 2-5 kb de séquences en amont est suffisante pour avoir l&#39;expression correcte et précise. </li><li> L&#39;ADNc du gène d&#39;intérêt peut être cloné de deux façons: <ol><li> Clonage classiques utilisant des enzymes de restriction. </li><li> Pour le clonage de la passerelle, il est amplifié par PCR utilisant des amorces qui contiennent la passerelle att séquence B recombinaison. L&#39;ADNc amplifié est d&#39;abord recombinés dans le vecteur donneur pDONR201 pour créer le vecteur d&#39;entrée et ensuite transformé en E. coli souche DH5a. Après la sélection de recombinants succès et mini-prep isolation de l&#39;ADN, le vecteur d&#39;entrée est recombinée dans le vecteur de destination promoteur contenant de créer le plasmide d&#39;expression. Détails sur le clonage par recombinaison sont disponibles à partir du manuel soit Passerelle Invitrogen ou dans Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marqueurs de sélection plasmidique Des exemples de plasmides marqueur transgénique comprennent rol-6 ou l&#39;utilisation du promoteur musculaire du corps murale unc-54 pour conduire l&#39;expression de protéines fluorescentes. Ces plasmides marqueur sont généralement disponibles au sein de la communauté de la recherche sur demande. Microinjection de C. elegans Préparation <ol><li> Effectuer isolement de l&#39;ADN des deux plasmides qui doivent être injectés. Les quantifier et les mélanger dans un rapport 1:1 de 50 ng / ul chacun. </li><li> Préparer coussinets agar: <ol><li> Faire une solution à 2% d&#39;agarose dans de l&#39;eau, la chaleur ou micro-ondes jusqu&#39;à dissolution. </li><li> Énonce plusieurs verres 22 x 50 mm sur un couvercle de paillasse. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur, déposer une goutte de l&#39;agarose fondu sur un couvercle en verre et placer immédiatement un couvercle en verre seconde sur la baisse à un angle de 90 à la première. Répétez l&#39;opération pour plusieurs verres couvrir d&#39;autres. Le diamètre du disque aplati d&#39;agarose doit être comprise entre 15-20 mm. </li><li> Après l&#39;agarose solidifié (Cela ne prend que des moments), retirez le couvercle en verre et de permettre le pad à l&#39;air complètement sec (plusieurs heures pour la nuit). </li><li> Boutique des plaquettes dans une boîte en verre couvercle à la température ambiante. </li></ol></li><li> Faire chargeurs aiguille pour la solution d&#39;ADN: Chargeurs aiguille sont créés à partir de 100 ul tubes capillaires qui sont chauffés au milieu sur une flamme nue et rapidement tiré à environ deux fois leur longueur. Les deux moitiés sont cassé dehors une fois le tube capillaire se refroidit. Des stocks de 10 à 20 chargeurs de seringues pour l&#39;injection. Conserver en position verticale dans un rack microtube. Faites preuve de prudence pour ne pas se empaler sur les points. </li><li> Faire des aiguilles de microinjection: L&#39;aiguille est fabriquée à partir d&#39;un tube capillaire spéciale qui contient un filament de verre interne; ce filament sert d&#39;une mèche pour la solution d&#39;ADN. Ce sont tirés sur une machine à aiguille extracteur. Nous utilisons un Narishige PP-830 Extracteur avec un réglage de chaleur de 24,8. Plusieurs aiguilles sont tirés à la fois et sont stockées dans une petite boîte en plastique. Aiguilles multiples peuvent être facilement &quot;monté&quot; sur une bande de pâte à modeler pour le stockage à long terme. </li><li> Pointe de l&#39;aiguille &quot;disjoncteurs&quot;: La pointe de l&#39;aiguille de microinjection est tiré si fine qu&#39;elle est effectivement fermé à son extrémité et doit être défoncé à l&#39;aide des tessons de verre petite couverture. Ce sont préparés par emballage de 18 x 18 mm couvercle en verre dans une serviette de papier et appliquer une pression doucement jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se brise en plusieurs morceaux. Les éclats d&#39;une taille utile est d&#39;environ 3 x 4 mm. </li><li> Cultivez de type sauvage (N2) vers le stade adulte au début d&#39;injection en utilisant des procédures standard de 6. Préparer environ 100 bien mis en scène des vers / construire injecté. </li></ol> Procédure <ol><li> Ouvrez la vanne principale sur un réservoir d&#39;hélium qui est relié à un bras de l&#39;aiguille de microinjection et titulaire. Fermez la vanne de régulation pour permettre au gaz d&#39;entrer dans la ligne, amenant la pression à 35 psi. Notez que le gaz peut être libéré à l&#39;aide d&#39;une pédale. </li><li> Insérez un chargeur aiguille dans un tube pipetteur bouche standard (trouvés dans des récipients de tubes capillaires en verre) et d&#39;établir une petite quantité du mélange plasmide (~ 1 pl). </li><li> Le chargeur de l&#39;aiguille est bien placée dans l&#39;extrémité arrière d&#39;une aiguille d&#39;injection et délicatement insérées tout au long de la longueur del&#39;aiguille jusqu&#39;à sentir une résistance. Expulser la solution d&#39;ADN en soufflant doucement, puis retirer le chargeur. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans le bras de micro-injection, en prenant soin de le placer dans le joint en caoutchouc internes de petite taille. </li><li> Placer un tesson aiguille bris de glace couvre sur un bord d&#39;un tampon d&#39;agar. Couvrir le fragment, ainsi que toute la surface du pad agar-agar, avec de l&#39;huile d&#39;halocarbures. Placez le tampon d&#39;agar sur la scène d&#39;un microscope inversé. </li><li> Position de l&#39;aiguille dans le centre du champ visualisation en utilisant l&#39;objectif 4X et l&#39;illumination en champ clair, mais n&#39;ont pas encore l&#39;abaisser dans l&#39;huile. En outre, la position du bord interne de l&#39;éclat de verre de couverture dans le centre, puis se concentrer sur elle (toujours avec l&#39;objectif 4X). Abaissez l&#39;aiguille dans l&#39;huile, le ramenant dans le même plan focal que l&#39;éclat de verre de couverture. Soulevez le grossissement en passant à l&#39;objectif 40X. Recentrage sur le bord du tesson et repositionner la pointe de l&#39;aiguille, si nécessaire. </li><li> Pour ouvrir la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection, doucement pousser l&#39;aiguille contre le bord du verre couvre éclat, tandis que dans le même temps l&#39;application d&#39;une impulsion courte de gaz via la pédale. L&#39;aiguille sera suffisamment rompu ouvert lorsque de petites gouttelettes de liquide échapper à la fin de l&#39;aiguille. L&#39;excès de flux liquide due à une trop grande ouverture n&#39;est pas souhaitable, car elle va tuer les animaux. </li><li> Enlever le tampon d&#39;agar de la scène en levant l&#39;aiguille en place, mais ne changent pas l&#39;X ou l&#39;axe Y de position. Faites glisser le stade de dessous de l&#39;aiguille, retirer le tampon d&#39;agar et le placer sur un microscope à dissection. Transfert d&#39;un ver sur le pavé, en dessous de la surface de l&#39;huile. Si le ver se tortille, doucement caresser jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche le pad agar. Le ver humide doit adhérer à la sécheresse agarose. </li><li> Injection <ol><li> Placer rapidement le dos pad agar sur la scène, le centrage le ver dans le champ de vision. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille dans le même plan d&#39;orientation que le ver. </li><li> Mettre le filtre à Hoffman éclairage (un type de filtre de contraste). Cela permet détails morphologiques du ver à devenir visibles. Si Nomarski / DIC optiques sont disponibles sur le champ inversé qui fonctionnera aussi bien. En utilisant l&#39;objectif 40X, se concentrer sur le &quot;grain&quot; centre syncytial de la gonade ver, en dessous du &quot;nid d&#39;abeille&quot; modèle des noyaux germinales (choisir le gonade est positionné sur le côté du ver face à l&#39;aiguille). </li><li> Ajustez la position de l&#39;aiguille jusqu&#39;à la pointe est également en discussion (le même plan que la gonade &quot;grain&quot;). </li><li> Insérer délicatement l&#39;aiguille dans le centre de la gonade et appliquer une brève impulsion de pression de gaz d&#39;expulser une goutte ou deux de l&#39;ADN dans le bras des gonades. Vous devriez observer une vague de propagation de liquide dans la gonade distale. Ne présumez pas plus de liquide est préférable, car trop de liquide peut couler dans le virage proximale du bras gonades, qui peut arrêter la production d&#39;ovocytes. Si possible, selon la position du ver, injecter le bras gonades d&#39;autres de la même manière. </li><li> Il est important de travailler rapidement tout en injectant un ver, car il peut facilement se dessèchent. La décision d&#39;injecter le bras gonades seconde dépend de la rapidité avec laquelle vous pouvez repositionner l&#39;aiguille et le ver. L&#39;ensemble du processus devrait idéalement prendre moins de 1-2 minutes. </li></ol></li><li> Retirez le couvercle en verre de la scène et placez-le sur un microscope à dissection. Appliquer 1 microlitre de M9 tampon (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm de NaCl, 1 mM MgSO 4) directement sur ​​le ver injecté (cela pourrait entraîner submergeant la pointe de la pipette en dessous de la surface de l&#39;huile d&#39;halocarbures). Le tampon doit réhydrater le ver, il sera alors flotter la surface du tampon d&#39;agarose. Transfert du ver à une plaque régulière en utilisant un pick ver. Le coussin d&#39;agarose peuvent être réutilisées plusieurs fois jusqu&#39;à ce qu&#39;il est devenu trop saturé de tampon et les vers ne plus adhérer. </li></ol> Sélection transgéniques <ol><li> Ver injecté, le P 0 génération, sont transférés à chaque nouvelle, les plaques des bactéries ensemencées (60 mm) et autorisé à reproduire. Typiquement, les animaux injectés sont incubées à 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu&#39;à ce que la progéniture apparaissent. </li><li> La progéniture F 1 sont observés pour les preuves du marqueur transgénique (telles que la fluorescence) en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes. Chaque fluorescentes, porteuse F 1, un animal cloné est séparément sur ​​une nouvelle plaque (depuis la progéniture de chaque F 1 sont considérées comme une ligne distincte). Le 1 F hermaphrodites sont autorisés à reproduire. Là encore, cela est généralement effectuée au moins 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu&#39;à ce que la progéniture apparaissent. </li><li> La génération F 2 est observée pour les animaux transgéniques ainsi. F 2 animaux qui ont hérité et d&#39;exprimer le tableau transgéniques sont considérées comme un «stable» en ligne. REMARQUE: Lors de la F 1 erâge, il peut y avoir beaucoup d&#39;animaux transgéniques, mais ils ne sont pas stables. La majorité des animaux transgéniques F 1 ne seront pas propagées dans F 2 lignées stables. REMARQUE: Pour le contrôle de la variabilité du nombre de copies du gène, de générer un minimum de trois lignes indépendantes stable par la construction injecté. </li><li> Chaque ligne indépendante stables devraient être maintenues sur une ligne distincte des vers. Chaque ligne peut être propagé par le transfert de plusieurs animaux transgéniques pour une nouvelle plaque à chaque génération, ce qui doit être effectuée en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes si le marqueur de sélection est fluorescent. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de: - Injecter directement dans le centre de la gonade - Ne pas injecter trop de liquide - Travailler rapidement pour empêcher la dessication. Si vous rencontrez des problèmes avec l&#39;aiguille, comme elle est cassée trop grand, il est préférable de refaire une aiguille neuve, plutôt que d&#39;essayer d&#39;injecter avec une aiguille de moins idéale. La génération des vers transgéniques a de nombreuses applications telles que: <br ...

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Huile d'halocarbone, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame de couverture 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Lame de couverture 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Lame de couverture 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire de 100 µl</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre pour aiguilles</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tire-à-aiguilles</td><td>Outil</td><td>Narishige International</td><td>Modèle PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Système microINJECTOR</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Microscope, Plateau, Manipulateur</td></tr><tr><td>Dissection, avec fluorescence</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Dissection</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de stable elegans transgéniques c. utilisation de microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Caenorhabditis elegans transgéniques peuvent être facilement créées via la micro-injection d&#39;une solution d&#39;ADN plasmidique dans l&#39;une des gonades. L&#39;ADN plasmidique réorganise pour former concatémères extrachromosomique qui sont héritées de façon stable, mais pas avec la même efficacité que les chromosomes réelle 2. Un gène d&#39;intérêt est co-injecté avec un marqueur évident phénotypiques, comme rol-6 ou GFP, pour permettre la sélection d&#39;animaux transgéniques sous un microscope à dissection. Le gène exogène peut être exprimée à partir de son promoteur natif pour les études de localisation cellulaire. Alternativement, le transgène peut être piloté par un promoteur différent tissu-spécifique d&#39;évaluer le rôle du produit du gène dans la cellule ou un tissu particulier. Cette technique entraîne efficacement l&#39;expression des gènes dans tous les tissus de C. elegans à l&#39;exception des cellules germinales de l&#39;embryon ou au début 3. Création d&#39;animaux transgéniques est largement utilisé pour une gamme de paradigmes expérimentaux. Cette vidéo montre la procédure de micro-injection pour produire des vers transgéniques. Par ailleurs, la sélection et le maintien de lignées transgéniques stables C. elegans est décrite.

Cette vidéo montre la technique de microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des animaux transgéniques.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Des Caenorhabditis elegans transgéniques peuvent être facilement créés par microinjection d'une solution de plasmide d'ADN dans la gonade 1. L'ADN plasmidique se réarrange pour...

Sea elegance est un organisme modèle incroyablement utile en raison de nos connaissances sur ses lignées cellulaires ainsi que de l'abondance d'informations obtenues grâce au séquençage et à l'analyse de son génome entier. Dans cette vidéo, nous démontrons le processus d'injection microscopique de plasmides dans sea elegance et la sélection de descendants transgéniques à l'aide de la microscopie à fluorescence. En tant qu'animal transparent et multicellulaire, sea elegance est idéal pour visualiser in vivo des transgènes exprimant des protéines marquées par un fluorochrome. Bonjour, je m'appelle Laura Berkowitz et je suis chercheuse associée au laboratoire Caldwell, au Département des sciences biologiques de l'Université de l'Alabama.Et je suis Adam Knight, également du laboratoire Calwell à l'Université de l'Alabama. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer et réaliser une microinjection de plasmine afin de produire des *C. elegans* transgéniques, et je vous montrerai également comment sélectionner et maintenir des lignées de *C. elegans* transgéniques. Commençons.Avant de commencer la microinjection, nous devons effectuer quelques étapes de préparation, que je vais vous montrer maintenant. Tout d'abord, préparez l'ADN plasmidique à injecter : deux plasmides sont nécessaires, l'un codant pour l'expression tissu-spécifique de notre gène d'intérêt, et le second fournissant un marqueur de transformation sélectionnable. Mélangez les plasmides ensemble dans un rapport un pour un de 50 nanogrammes par microlitre.À chaque fois, préparez des plaques à vis, qui seront utilisées pour immobiliser les vers en vue de l'injection. Pour fabriquer les plaques à vis, placez d'abord plusieurs lamelles de 22 par 50 millimètres sur le plan de travail. À l’aide d’une pipette Pasteur, déposez une goutte d’agarose fondue à 2 % sur une lamelle, puis placez immédiatement une seconde lamelle par-dessus la goutte, à un angle de 90 degrés par rapport à la première.Laisser la couche aéro se solidifier pendant quelques secondes, puis retirer le verre de couverture supérieur. Le diamètre du disque aplati doit être compris entre 15 et 20 millimètres. Comme pour une culture, laisser sécher complètement la lame à l'air libre pendant plusieurs heures ou toute une nuit.Une fois secs, conserver les pastilles dans une boîte en verre couvercle à température ambiante. Ensuite, préparer les chargeurs d'aiguille pour la solution d'ADN. Pour ce faire, prendre un tube capillaire de cent microlitres et le chauffer au milieu d'une flamme nue, puis le tirer rapidement jusqu'à environ deux fois sa longueur.Une fois que le tube capillaire est refroidi, séparez les deux moitiés d'un coup sec. Stockez 10 à 20 chargeurs d'aiguille pour l'injection. Vous pouvez les conserver verticalement dans un tube de microcentrifugeuse.Brack, faites attention. Les pointes du chargeur d'aiguilles sont très tranchantes. Préparez maintenant les aiguilles de micro-injection.Ces aiguilles sont fabriquées à partir d'un tube capillaire spécial contenant un filament de verre interne. Ce filament sert de mèche pour la solution d'ADN. Pour fabriquer les aiguilles, nous utilisons un appareil Niki PP eight 30 Polar avec un réglage de température de 24,8 ; plusieurs aiguilles sont tirées simultanément afin d'être stockées.Plusieurs aiguilles peuvent être montées sur une bande d'argile à modeler. De petits éclats de lame de couverture seront utilisés pour ouvrir la pointe de l'aiguille étirée. Ces éclats sont préparés en enveloppant une lame de couverture de 18 sur 18 millimètres dans un essuie-tout Kim et en appliquant délicatement une pression jusqu'à ce qu'elle se brise en plusieurs morceaux.Utilisez des fragments d'environ trois sur quatre millimètres de taille. En plus de préparer l'ADN et les aiguilles, préparez environ 50 à 100 vers sauvages correctement stagés pour chaque construction de vecteur d'expression à injecter.Nous sommes maintenant prêts à installer le microscope de microinjection. Pour commencer l'installation du microscope, ouvrez la vanne principale du réservoir d'hélium relié au bras et au support de l'aiguille de microinjection. Fermez le régulateur pour permettre au gaz d'entrer dans la conduite.En portant la pression à 35 PSI, le gaz peut être libéré à l’aide d’une pédale. Ensuite, insérez un chargeur d’aiguille dans un tube de pipette buccale standard et déposez une petite quantité du mélange de plasmide, environ un microlitre. Insérez maintenant délicatement le chargeur entièrement à travers l’aiguille de microinjection jusqu’à ce qu’une résistance soit ressentie.Expulsez la solution d'ADN en soufflant doucement, puis retirez le chargeur. Une fois l'ADN chargé, insérez l'aiguille dans le bras de microinjection, en prenant soin de la placer à l'intérieur du petit joint en caoutchouc interne, puis fixez-la au bras du manipulateur. Placez ensuite un éclat de verre de couverture servant à casser les aiguilles sur un bord du tampon de vis sans fin.Couvrez le fragment ainsi que toute la surface du coussinet de forage avec de l'huile de carbone creuse. Ensuite, placez le coussinet de forage sur la platine d'un microscope inversé. Une fois le coussinet de forage en place, positionnez l'aiguille au centre du champ de vision à l'aide de l'objectif Forex et d'un éclairage en champ clair, mais ne l'abaissez pas encore dans l'huile.Positionnez ensuite le bord interne du fragment de lame couvre-objet au centre, puis faites la mise au point dessus. Abaissez l'aiguille dans l'huile, en la plaçant dans le même plan focal que le fragment de lame couvre-objet. Augmentez le grossissement en passant à l'objectif 40 x, puis refaites la mise au point sur le bord du fragment et repositionnez la pointe de l'aiguille si nécessaire.Brisez maintenant l'extrémité de l'aiguille d'injection. Pousser délicatement l'aiguille contre le bord du fragment de lame de verre, tout en appliquant simultanément une courte impulsion de gaz à l'aide de la pédale. L'aiguille sera suffisamment ouverte.Lorsque de petites gouttelettes de liquide s'échappent de l'extrémité de l'aiguille en raison d'un écoulement excessif dû à une ouverture trop grande, cela n'est pas souhaitable car cela tuerait les animaux. Une fois l'aiguille prête, nous commençons la microinjection. Ensuite, retirez le tampon poussoir de la platine en soulevant l'aiguille.Mais ne modifiez pas la position des axes X ou Y. Faites glisser la platine hors de sous l'aiguille. Retirez le tampon de la vis sans fin et placez-le sur un microscope stéréo.Transférez un ver sur le tampon situé sous la surface de l'huile. Si le ver se tortille, caressez-le doucement jusqu'à ce qu'il entre en contact avec le tampon de prélèvement ; le ver humide doit adhérer au tampon sec. Replacez rapidement le tampon de prélèvement sur la platine, en centrant le ver dans le champ de vision.Abaissez ensuite l'aiguille jusqu'au même plan de focalisation que le ver. Basculez les filtres du microscope inversé sur l'éclairage Hoffman. Ce filtre de contraste permet de rendre visibles les détails morphologiques du ver.À l’aide de l’objectif 40 x, focalisez sur le centre sensoriel granuleux du gonade du vers situé sous le motif en nid d’abeille des noyaux germinatifs. Choisissez le gonade qui se trouve du côté du vers orienté vers l’aiguille. Réglez précisément la position de l’aiguille jusqu’à ce que la pointe soit également au point.Insérez délicatement l'aiguille au centre du gonade et appliquez une brève impulsion de pression gazeuse pour expulser une ou deux gouttelettes d'ADN dans le bras du gonade. Avec beaucoup d'entraînement et d'habileté, vous devriez observer une onde liquide se propager à travers le gonade distal. Vous pouvez atteindre le centre du gonade à chaque fois.Gardez à l'esprit qu'il est important de travailler rapidement lors de l'injection d'un ver, car il peut facilement se dessécher. L'ensemble du processus devrait idéalement prendre moins de une à deux minutes.Une fois l'injection terminée, retirez le coussin de la vis sans fin du plateau et placez-le sous un microscope stéréo. Appliquez un microlitre de tampon M neuf directement sur le ver injecté. Cela peut nécessiter d'immerger la pointe de la pipette sous la surface de l'huile halo carb.Le tampon doit réhydrater le ver, qui flottera ensuite à la surface du tampon aérosol ; transférez le ver sur une plaque ordinaire à l’aide d’un curet. Je vais maintenant remettre les vers injectés à Adam, qui nous montrera le processus de sélection et de maintien des lignées transgéniques. Les vers injectés sont transférés individuellement sur des plaques fraîches de 60 millimètres ensemencées et laissés à se reproduire.Ces vers représentent la génération P zéro. Généralement, les animaux injectés sont incubés à 20 degrés Celsius pendant deux à trois jours, jusqu'à l'apparition de la descendance. Une fois la descendance apparue, nous pouvons commencer le criblage des vers transgéniques.Les descendants F1 sont observés afin de détecter la présence du marqueur transgénique. Dans ce cas, le marqueur sélectionnable est fluorescent, ce qui permet de réaliser un criblage à l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence. Chaque animal porteur du marqueur fluorescent de la génération F1 est cloné individuellement sur une nouvelle boîte.Le P zéro injecté peut produire seulement un à cinq descendants fluorescents parmi tous ses F1. Laisser les hermaphrodites F1 se reproduire à 20 degrés pendant deux à trois jours jusqu'à l'apparition des descendants. Une fois la génération F2 prête, on observe également la présence d'animaux transgéniques. Les animaux F2 ayant hérité et exprimé un marqueur transgénique sont considérés comme une lignée stable.Chaque lignée stable indépendante doit être maintenue comme une lignée distincte ; propager chaque lignée en transférant plusieurs animaux transgéniques sur une nouvelle boîte à chaque génération. Cette opération doit être effectuée à l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence. Si le marqueur sélectionnable est fluorescent, afin de contrôler la variabilité du nombre de copies du gène, générer un minimum de trois lignées stables indépendantes par construct injecté.Nous venons de vous montrer comment réaliser une microinjection de constructions vectorielles d'expression et observer elgan, ainsi que sélectionner des lignées stables. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Ce protocole décrit une procédure rapide et peu consommatrice de matériaux pour l’intégration de réseaux extrachromosomiques transgéniques dans le génome de Caenorhabditis elegans en utilisant l’irradiation ultraviolette (UV). De plus, ce protocole est particulièrement bien adapté aux lignées transgéniques qui transmettent des réseaux extrachromosomiques à un rythme élevé.

Un protocole rapide pour l’intégration de puces extrachromosomiques à haut taux de transmission dans le génome de C. elegans

C. elegans est généralement cultivées sur des plaques de gélose solide ou dans des cultures liquides ensemencés avec E. coli. Pour éviter des sous-produits bactériens de confondre les études toxicologiques et nutritionnels, nous avons utilisé un milieu liquide axénique, CEHR, de croître et de synchroniser un grand nombre de vers pour une gamme d'applications en aval.

Culture Caenorhabditis elegans En Axenic Liquid Media et création d'transgéniques Worms par bombardement de microparticules

La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

La boîte à outils génomique fonctionnelle pour les nématodes parasites Strongyloides stercoralis et Strongyloides ratti comprend la transgénèse, la mutagénèse médiée par CRISPR / Cas9 et l’ARNi. Ce protocole montrera comment utiliser la microinjection intragonadienne pour introduire des transgènes et des composants CRISPR dans S. stercoralis et S. ratti.

Génération de transgéniques et de Knockouts chez les espèces de strongyloïdes par microinjection

Un flux de travail de microinjection CRISPR/Cas9 pour le marquage fluorescent endogène dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans afin d’obtenir des lignées de knock-in homozygotes pour une analyse in vivo de la localisation des protéines.

Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans

Apprenez la microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des lignées transgéniques stables. Cette méthode permet de visualiser l'expression génique in vivo par fluorescence.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

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