La méthode MODS pour le diagnostic de la tuberculose et la tuberculose multirésistante

Pour trois personnes dans le monde, une est infectée par la tuberculose. Le diagnostic de la tuberculose active prévient de nouvelles infections, car les patients atteints de tuberculose active infecteront entre 10 et 15 autres personnes par an jusqu’au moment où elles seront traitées ou mourront. Mods est un acronyme que nous utilisons pour éviter d’avoir à parler d’observation microscopique, de test de sensibilité aux médicaments, et la raison pour laquelle on l’appelle cela deviendra évidente au fur et à mesure que la méthodologie sera expliquée.

Dans la courte vidéo, nous décrirons la méthodologie mods pour le diagnostic rapide et peu coûteux de la tuberculose et de la tuberculose multirésistante. La vidéo présente la méthodologie étape par étape. Nous discuterons des implications en matière de biosécurité du travail avec la culture liquide, et nous expliquerons également certaines des questions importantes d’assurance de la qualité qui sont requises pour l’utilisation de cette méthodologie.

Le test mods a été développé à l’Université Kayana de Lima, au Pérou, dans le laboratoire de Bob Gilman. Suite aux observations initialement faites par des cavi libres. LOOSE tentait d’identifier des moyens rapides de détecter mycobacterium tuberculosis dans les cultures à l’aide d’indicateurs colormétriques.

Mais elle a noté que l’observation de ces cultures au microscope a révélé la présence de la croissance de microbactéries plusieurs jours avant que les indicateurs colormétriques ne changent de couleur, et c’est sur la base de cette observation que le test du ministère de la Défense a été développé. Le test du ministère de la Défense a été mis au point dans un contexte de ressources limitées et s’adresse à des contextes à ressources limitées, soit un peu moins de 3 tests par test pour la détection de la tuberculose basée sur la culture liquide et la détection de la multirésistance aux médicaments. C’est extrêmement attrayant et, pour la première fois, il apporte ce genre de capacité de diagnostic dans des endroits où les ressources sont limitées.

Le dosage des mods est donc basé sur trois principes centraux. La première est que Mycobacterium tuberculosis se développe beaucoup plus rapidement dans les milieux liquides que dans les milieux solides. C’est un fait qui est connu depuis de nombreuses années.

Deuxièmement, si nous observons ces milieux liquides au microscope, nous pouvons détecter la croissance de myb tuberculosis beaucoup plus rapidement que d’attendre l’apparition macroscopique de colonies sur des milieux solides. Et en effet, cette croissance est tout à fait caractéristique de sorte que nous pouvons distinguer M tuberculosis dans les milieux liquides de la contamination bactérienne ou fongique, ou même de la croissance de mycobactéries non tuberculeuses atypiques qui pourraient être présentes. Enfin, et c’est peut-être la chose la plus excitante à propos du dosage des mods, c’est que nous pouvons incorporer les médicaments comme la rifampicine et donc la multirésistance aux médicaments directement à partir des expectorations.

En utilisant ces médicaments dès le début de l’essai, nous pouvons détecter à la fois la tuberculose et en même temps si l’isolat est résistant ou non à ces deux médicaments. Et cela évite la nécessité de sous-cultiver et de créer un test de sensibilité aux drogues indirectes. Nous allons maintenant décrire l’équipement nécessaire pour effectuer le test des modifications.

Un réfrigérateur est nécessaire pour stocker les milieux préparés. Une balance est nécessaire pour peser l’is et la rifampicine. Un vortex est nécessaire pour le mélange des expectorations.

Avec la solution de décontamination, une centrifugeuse est nécessaire pour concentrer l’échantillon d’expectoration décontaminé, et cela devrait être capable d’atteindre 3000 G.La centrifugeuse n’a pas besoin d’être réfrigérée, mais il est absolument essentiel qu’elle soit sans danger pour le bios et pour être en sécurité pour le bios. Pour les travaux mycobactériens qui nécessitent que les seaux de la centrifugeuse puissent être scellés avec des couvercles verrouillables. Un incubateur capable d’atteindre 37 degrés et de maintenir 37 degrés centigrades est nécessaire.

Il n’est pas nécessaire qu’il soit enrichi en CO2. Un microscope inversé est nécessaire pour lire les plaques mods, et cela doit avoir des objectifs de quatre x et 10 x et un autoclave est nécessaire pour stériliser les milieux et aussi pour l’élimination de la culture microbactérienne, les déchets micros sont nécessaires pour l’aliquote dans les milieux, une enceinte de sécurité biologique. La classe deux est requise pour les procédures impliquant la manipulation d’échantillons d’expectorations et l’inoculation de plaques.

Les réactifs nécessaires pour effectuer les modifications sont les suivants, Middlebrook sept H neuf média cascione et glycérol Panta, qui est le supplément antibiotique et OADC. Les stocks de suppléments nutritionnels des antibiotiques sont la rifampicine diméthylsulfoxyde, le DMSO pour la préparation de la rifampicine, l’hydroxyde de sodium, le citrate de sodium et la nylcystéine pour la décontamination des expectorations, le phosphate de sodium et le phosphate monopotassique pour la préparation du tampon de phosphate, l’hypochlorite de sodium à 10 % pour l’élimination des déchets infectés et le désinfectant pour le nettoyage des surfaces de travail. Les plastiques et consommables suivants sont également requis : tubes en verre stériles, filtres de 0,2 micromètre pour les solvants aqueux et filtres de 0,2 micromètre pour les solvants organiques, microtubes à centrifuger, tubes à centrifuger de 15 mil, tubes sérologiques stériles de 50 millilitres, peppes de 10 millilitres et de peppes, pointes de micropipettes stériles à 24 puits, plaques de type culture tissulaire et sacs scellables de type Ziploc, dont les plaques à 24 puits sont placées après l’inoculation de l’échantillon d’expectoration dans le milieu.

Il existe quatre groupes de solutions-mères qui peuvent être préparées à l’avance. La solution tampon phosphate est composée d’une combinaison de solutions monobasiques de phosphate de sodium, de diba et de phosphate de potassium ajustée à un pH de 6,8 plus ou moins 0,2. Cette solution est autoclavée à 121 à 124 degrés centigrades pendant 15 minutes pour la stérilisation, et une aliquote est cultivée sur de la gélose nutritive pour confirmer la stérilité.

Il peut être conservé au réfrigérateur à une température de deux à huit degrés centigrades jusqu’à un mois. Chaque échantillon d’expectoration nécessite 10 millilitres de solution tampon de phosphate. La solution mère pour la décontamination des expectorations est une combinaison d’hydroxyde de sodium et de citrate de sodium.

Ces solutions sont combinées en volumes égaux et en autoclave à 121 à 124 degrés centigrades pendant 15 minutes et peuvent également être conservées au réfrigérateur à deux à huit degrés centigrades jusqu’à un mois. Deux millilitres de cette solution sont nécessaires pour chaque échantillon d’expectoration. Le milieu de culture de base est composé de Middlebrook sept H neuf avec du cascione et du glycérol.

La poudre de sept H neuf est dissoute dans de l’eau distillée stérile contenant du glycérol et du cascione et mélangée avec une agitation constante jusqu’à dissolution complète. Ce milieu est autoclave à 121 à 124 degrés centigrades pendant 15 minutes et, après refroidissement, il est divisé en quats de 4,5 millilitres dans des tubes de verre stériles de 16 x 100 millimètres. Le milieu est incubé à 37 degrés pendant 48 heures pour vérifier la stérilité, qui est indiquée par une absence de turbidité après cette période et peut être stocké à une température de deux à huit degrés centigrades avec le capuchon bien fermé jusqu’à un mois.

Chaque échantillon d’expectoration nécessite un tube contenant 4,5 millilitres de cette culture. Les solutions mères d’antibiotiques moyennes sont préparées comme suit, se dissolvent complètement dans de l’eau distillée stérile et sont filtrées avec un filtre à seringue de 0,2 micromètre pour les solvants aqueux. Des aliquotes de 20 microlitres peuvent ensuite être stockées dans des tubes de micro-centrifugation stériles à moins 20 degrés centigrades pendant une période pouvant aller jusqu’à six mois, chaque aliquote de 20 microlitres suffit pour un maximum d’une centaine d’échantillons.

Des solutions mères de rifampicine de huit milligrammes par mil sont préparées en dissolvant la rifampicine dans du DMSO et de l’eau distillée stérile. Ce mélange est filtré à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micromètre pour les solvants organiques et la solution peut être stockée dans des aliquotes de 20 microlitres dans des tubes de micro-centrifugeuse stériles à moins 20 degrés centigrades jusqu’à six mois ; chaque aliquote de 20 microlitres est suffisante pour un maximum de 100 échantillons. Nous arrivons maintenant à la partie de la méthodologie elle-même et aux trois étapes que vous devez suivre le jour de la procédure.

Il s’agit de convertir les solutions mères en solutions de travail. D’abord, nous avons la solution de décontamination, puis nous avons la solution des médias. Et enfin, les solutions de travail des médicaments isen et rifampicine.

La méthode de décontamination, qui est utilisée pour la méthodologie mods, est la méthode normalisée de décontamination à l’hydroxyde de sodium. Le nalk est un mucolytique, qui aide à digérer les expectorations et permet à l’hydroxyde de sodium de faire la décontamination. Pour cela, nous avons besoin de notre solution mère de citrate de sodium hydroxyde de sodium et de 0,1 gramme de NA est ajouté à 20 ml de cette solution.

Toute solution qui n’est pas utilisée le jour de la préparation doit être jetée. La préparation finale du milieu de culture ne doit également être effectuée que le jour de l’utilisation. Stocké sept milieux H neuf est combiné avec OADC et panta 4,5 millilitres de support sont combinés avec 0,5 millilitres d’OADC et 0,1 millilitres de Panta dans chaque tube.

Cela suffit pour un échantillon. Les solutions de travail de chaque médicament sont préparées le jour de l’utilisation et toutes les solutions qui ne sont pas utilisées doivent être jetées car l’activité ne peut être garantie, les aliquotes stockées sont diluées dans 24. Plaques de culture tissulaire en série avec des milieux sept H neuf oh A DC de sorte que la concentration finale du puits obtenue après l’ajout de l’échantillon d’expectoration avec le milieu soit de 0,4 microgramme par mil d’acide forique et d’un microgramme par mil pour la rifampicine.

Passons maintenant à la procédure de décontamination, deux mils d’échantillon d’expectoration sont placés dans un tube Falcon à base conique et deux mils de notre solution de décontamination de lait à base d’hydroxyde de sodium sont ensuite ajoutés. Le couvercle est remis en place et vissé fermement, après quoi la suspension est tourbillonnée et laissée au repos pendant 15 minutes, pendant lesquelles la procédure de décontamination a lieu. Après ce temps, 14 millilitres de solution tampon de phosphate sont ajoutés.

Le couvercle est remis en place et vissé, et le tube est placé dans la centrifugeuse après 50 minutes à 3000 G, le surnageant S est décanté et la pastille qui reste est l’échantillon que nous souhaitons plaquer à l’aide des tubes de 5,1 millilitres de sept panter H neuf OEDC. Notre granulé est remis en suspension à un volume d’environ deux millilitres. La moitié de cet échantillon remis en suspension est stockée en sauvegarde dans un microtube à centrifuger.

Celui-ci est alors disponible au cas où notre culture serait contaminée et que nous aurions besoin de replacer l’échantillon. L’autre millilitre est ajouté aux sept H neuf restants oh un panter DC qui se trouve dans notre tube de verre, et c’est notre échantillon qui est prêt à être plaqué. 900 microlitres de cette suspension de milieu et d’échantillon sont placés dans chacun des quatre puits d’une colonne d’une plaque de 24 puits.

Les puits restants de la plaque de 24 puits sont remplis avec des échantillons subséquents, de sorte que cinq échantillons remplissent une plaque de 24 puits, un pour chacune des cinq colonnes, et la sixième colonne est laissée sans échantillon. La sixième colonne sert de contrôle négatif dans cette colonne. Il a placé tous les constituants du milieu sans échantillon d’expectoration et il est clair que toute croissance dans cette colonne indique que nous avons un problème de contamination croisée et que toute la plaque doit être jetée.

Chaque plaque que nous exécutons nécessite une colonne de contrôle négatif. Nous avons donc maintenant notre assiette contenant tous nos échantillons et supports. Nous devons ajouter nos suspensions d’antibiotiques dans une assiette séparée.

Nous avons préparé nos dilutions comme décrit précédemment de Rifampicine et d’Isid, et avec un multi PET à quatre canaux, nous collectons 100 microlitres de chacun de ces puits et distribuons 100 microlitres de sept H neuf OADC à chacun des deux puits de contrôle et 100 microlitres de rifampicine et 100 microlitres d’isid à chacun des deux puits contenant du médicament. Une fois l’assiette terminée, le couvercle est remis en place et il est placé à l’intérieur. À partir de ce moment, un sac Ziploc n’est plus ouvert et, par conséquent, les cultures qui poussent dans un milieu liquide n’ont jamais la possibilité de quitter le sac.

Toutes les lectures de la plaque se font désormais à l’intérieur du sac, et le sac est placé dans un sac autoclave et jeté à la fin de la culture. Et de cette façon, nous évitons la manipulation de suspensions hautement concentrées de mycobactéries. Nous allons maintenant dire quelques mots sur le contrôle de la qualité.

La méthodologie des mods comporte des contrôles de qualité intégrés, qui sont essentiels à la bonne utilisation du test. Tout d’abord, il y a des contrôles négatifs et ceux-ci sont exécutés sur chaque plaque. Ceux-ci ont été mentionnés précédemment, mais en résumé, nous avons une colonne qui contient tous les constituants du milieu sans la présence d’un échantillon d’expectoration à côté de cinq autres échantillons d’expectoration sur une plaque, les puits de la colonne doivent être examinés comme n’importe quel autre puits et la présence de toute croissance dans ces puits indique que la contamination croisée a eu lieu et qu’aucun des résultats sur la plaque n’est donc fiable.

La plaque doit donc être jetée et tous les échantillons doivent être replaqués. De plus, il existe des contrôles internes qui sont des contrôles positifs. Celles-ci sont analysées sur une plaque séparée, et cette plaque est préparée après que toutes les autres plaques d’échantillon ont été préparées à la fin de la journée afin de minimiser le risque de contamination croisée au sein du laboratoire.

Sur cette plaque séparée, nous analysons une souche entièrement sensible de Mycobacterium tuberculosis et une souche résistante à l’isid et à la rifampicine. S’il y a des préoccupations concernant l’application d’une souche multirésistante sur une plaque, une souche monorésistante à la rifampicine peut être exécutée sans cette souche monorésistante à la place de ces deux souches sensibles et multirésistantes. Le but de ces souches est de démontrer non seulement que les milieux soutiennent la croissance, donc tous nos contrôles positifs devraient avoir une croissance dans la richesse sans médicament, mais aussi que nos concentrations de médicament sont correctes et donc les contrôles positifs sensibles ne devraient pas croître en présence de is et de rifampicine et les contrôles positifs résistants devraient évidemment croître à travers les concentrations de rifampicine et est qui sont présentes dans la plaque.

D’accord, passons maintenant à la lecture des plaques. Si l’on considère le jour du placage de nos échantillonneurs, la lecture des plaques du jour zéro commence le cinquième jour. Avant cela, la croissance mycobactérienne est très rarement observée.

Les plaques sont examinées au microscope à lumière inversée. C’est-à-dire que les plaques sont examinées de bas en haut, ce qui nous permet de voir très clairement les cordes, la tentative de visualiser les cultures d’en haut est gênée par la condensation sur le couvercle des plaques, et aussi parce que la distance focale n’est pas adéquate d’un microscope standard. L’examen microscopique est généralement entrepris avec les cultures positives 10 x objectives considérées comme une dans laquelle il y a au moins deux unités formant des colonies dans les deux puits exempts de médicament.

La présence d’une contamination est facilement reconnaissable parce que le milieu devient trouble et qu’au cinquième jour, il y a généralement une prolifération de la majeure partie du puits. En revanche, la croissance mycobactérienne ne conduit pas à une turbidité du puits la croissance initiale des mycobactéries forme de petites formes semblables à des virgules, qui progressent régulièrement pour former des cordes ou des enchevêtrements caractéristiques. En deux semaines, une croissance fortement positive aura formé des conglomérats de mycobactéries avec des cordons seulement vraiment visibles aux extrémités.

La grande majorité des cultures qui vont devenir positives sont positives au 14e jour, et nous recommandons donc des lectures quotidiennes du cinquième au 14e jour, puis des lectures tous les deux ou trois jours en fonction de la charge de travail du laboratoire. Toute croissance en présence de l’un ou l’autre médicament indique une résistance à ce médicament. Il est très important de noter que si la région des puits contenant le médicament est effectuée plus d’une semaine après qu’une culture positive a été notée dans les puits exempts de médicament, cela peut ne pas représenter une résistance, car une croissance percée occasionnelle est observée.

Les lectures peuvent s’arrêter au jour 21 si une culture est négative, car les cultures positives après cette période ne sont jamais rencontrées chez les patients ne recevant pas de traitement À la fin des 21 jours d’incubation, les cultures peuvent être jetées. Les cultures restent dans leurs sacs Ziploc et sont placées dans des sacs autoclaves et un autoclave à 121 à 124 degrés centigrades pendant 45 à 60 minutes, après quoi elles peuvent être jetées en toute sécurité. Je vais juste dire quelques mots maintenant sur la biosécurité et le test des mods, car nous avons déployé des mods non seulement au Pérou, mais aussi dans des contextes en Afrique et en Asie.

Une question récurrente se pose sur la sécurité et la biosécurité de l’utilisation de cultures microbactériennes dans des milieux liquides. C’est une crainte compréhensible parce qu’il est évident que des liquides peuvent être renversés et que les milieux solides ne comportent pas ce risque, et il y a aussi un risque d’aérosolisation lorsque nous avons affaire à des suspensions de mycobactéries. C’est en fait pour ces mêmes raisons que nous pensons que la méthodologie mod est une méthodologie plus sûre que toute méthodologie nécessitant des tests indirects de sensibilité aux drogues.

La raison en est que pour les tests de sensibilité indirecte, une suspension d’une concentration connue de microbactéries est préparée. Il s’agit donc de manipuler des solutions hautement concentrées de microbactéries avec tous les risques de déversement et d’aérosolisation qui en découlent. En revanche, la méthodologie mods, comme vous l’aurez vu maintenant, implique simplement l’inoculation d’un échantillon d’expectoration dans notre plaque, après quoi la plaque est scellée dans un sac en plastique.

Ce sac n’est plus jamais ouvert, et nous n’avons donc pas à faire face à ces suspensions hautement concentrées. Cela ne veut pas dire que nous pensons que la méthodologie mod est totalement sûre, la manipulation des mycobactéries comporte toujours un risque. Cependant, des données provenant de Corée publiées en 2006 semblaient avoir justifié notre position selon laquelle les mods ne sont pas plus dangereux que de repousser n’importe quelle autre culture.

Il s’agit d’une étude qui a été entreprise chez des travailleurs de laboratoire, qui a montré que les risques professionnels pour les travailleurs de laboratoire qui ont plaqué des cultures et qui n’étaient pas responsables des tests de sensibilité aux médicaments n’étaient pas plus importants que ceux qui faisaient de la microscopie des frottis d’expectoration. En revanche, ceux qui manipulent des suspensions de mycobactéries et effectuent des tests de sensibilité aux médicaments ont des taux beaucoup plus élevés de risque professionnel de tuberculose. De toute évidence, il est d’une importance primordiale que tout le personnel du laboratoire de travail soit protégé dans la mesure du possible, et nous recommandons donc fortement qu’aucune de ces procédures ne soit effectuée sans une protection respiratoire individuelle appropriée, c’est-à-dire des masques standard N95.

De plus, une enceinte de sécurité biologique ou une hotte de classe deux est requise dans laquelle toutes les zones évacuées sont filtrées à travers des filtres HEPA. Enfin, un mécanisme simple qui est très important pour éviter les turbulences du flux d’air dans un laboratoire est une serrure sur la porte du laboratoire pour arrêter l’entrée et la sortie du personnel pendant le traitement des échantillons. Cela réduit le risque de transmission au sein du laboratoire, J’espère donc que cela vous donne un bon aperçu de ce que la méthodologie mods implique et de son utilité dans des contextes où les ressources sont limitées, mais où des diagnostics de haute qualité de la tuberculose et de la tuberculose multirésistante sont nécessaires de toute urgence.

Pour plus d’informations, vous pouvez visiter notre site Web, mods peru.org, où vous trouverez nos procédures d’utilisation standard détaillées, le guide de l’utilisateur des mods. En plus des SOP pour le traitement des échantillons pulmonaires supplémentaires, nous disposons également d’une photothèque de mycobactéries et de tuberculose, d’autres mycobactéries et de contaminations bactériennes et fongiques, et vous pouvez également trouver notre stratégie d’assurance qualité et la procédure que nous recommandons pour l’accréditation des laboratoires pour commencer à utiliser les mods.

Enfin, il y a une foire aux questions, et nous accueillons tous les commentaires des utilisateurs qui utilisent actuellement des mods, car il s’agit d’une méthodologie itérative. Comme nous l’avons expliqué précédemment, il s’agit d’un test non propriétaire et nous sommes toujours intéressés par les améliorations que d’autres laboratoires ont réussi à apporter.