Name: Protocoles pour linfection orale des larves de lépidoptères avec des baculovirus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-03T23:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Découvrez les techniques d'infection orale de larves de lépidoptères par baculovirus pour évaluer l'efficacité insecticide. Ce protocole utilise des bioessais par gouttelette et par cube de nourriture.

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S&#39;il vous plaît visitez <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Protocoles Springer</a> en apprendre davantage sur le baculovirus d&#39;ingénierie comme un agent insecidical et les techniques infection orale utilisés dans ce dosage.

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

protocoles pour l&#39;infection orale des larves de lépidoptères avec des baculovirus

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Les baculovirus sont largement utilisées comme vecteurs d&#39;expression de protéines et d&#39;insectes agents de lutte antiparasitaire. Cette vidéo montre comment les larves de lépidoptères peuvent être infectés par des polyèdres en se nourrissant de gouttelettes et de l&#39;alimentation plug-essais réalisés au moyen. Ce qui accompagne Springer Protocoles section donne un aperçu du cycle de vie de baculovirus et l&#39;utilisation de baculovirus comme agents insecticides, y compris la discussion des avantages et des inconvénients de l&#39;utilisation des baculovirus comme insecticides, et les progrès accomplis dans l&#39;amélioration génétique des baculovirus pour l&#39;efficacité insecticide amélioré.

Dans cette vidéo, nous avons la démonstration des techniques d&#39;infection orale avec des larves de lépidoptères baculovirus afin de déterminer l&#39;efficacité insecticide.

Protocoles pour l&#39;infection orale des larves de lépidoptères avec des baculovirus

Les baculovirus sont largement utilisés à la fois comme vecteurs d'expression protéique et comme agents de lutte contre les insectes nuisibles. Cette vidéo montre comment des larves de lépidoptères peuvent être...

Le virus Vao est couramment utilisé comme vecteur d'ADN en combinaison avec des lignées cellulaires d'insectes pour l'expression de protéines. Toutefois, le fait que ce virus infecte efficacement les insectes avec des conséquences létales en fait également un agent insecticide efficace. Au Brésil, par exemple, le virus balo de type sauvage est appliqué sur plus d'un million d'hectares de cultures de soja chaque année afin de lutter contre la chenille du haricot velu. Pour améliorer leur efficacité insecticide, les virus Balo ont été modifiés génétiquement en incorporant des gènes codant des toxines spécifiques aux insectes, actives au sein de l'hémolymphe de l'insecte.Dans cette vidéo, nous démontrons des méthodes d'infection orale de larves de lépidoptères avec le virus bacao afin d'analyser l'efficacité insecticide. Bonjour, je viens du laboratoire Blind Boning du Département d'ophtalmologie de l'Université d'État de l'Iowa, et je suis Wendy Sparks, également du laboratoire Boning. Aujourd'hui, nous allons vous montrer deux procédures d'infection des larves de lter par le virus VA.Tout d'abord, Harran vous montrera comment infecter des larves néonates à l'aide d'un bioessai par alimentation en gouttelettes. Ensuite, je vous montrerai comment infecter des larves de stades intermédiaires à tardifs à l'aide d'un bioessai avec un régime contenant du sang. Commençons donc.Les bioessais par alimentation en gouttelettes peuvent être utilisés pour déterminer la dose létale de l'abacavir et la survie en fonction du temps chez les larves infectées par le virus balo. Les larves de jeunes stades ou néonates sont généralement utilisées pour ce bioessai.Avant de commencer, assurez-vous de disposer de godets alimentaires contenant le régime approprié. Préparez également les dilutions de virus appropriées, incluant un colorant alimentaire vert à une concentration de 4 % en volume. Afin de déterminer la concentration létale du virus, la dilution doit produire un taux de mortalité compris entre 1 et 99 %. Des bioessais préliminaires peuvent être nécessaires pour établir une gamme appropriée de concentrations virales. Après avoir vortexé le tube afin d'éviter le dépôt des polyèdres, déposez deux cercles concentriques de petites gouttelettes de la solution virale dans une boîte de Pétri de 60 millimètres.Pour chaque concentration de virus utilisée, pensez également à préparer une infection témoin négative. Ensuite, transférez 25 à 30 larves néonates au centre des cercles concentriques à l’aide d’un pinceau stérile. Placez le couvercle sur la boîte et scellez-le avec du paraform pour empêcher les larves de s’échapper.Idéalement, utilisez des pinceaux différents pour le transfert à chaque type de virus afin d'éviter la contamination entre les traitements. Laissez le plat reposer à température ambiante pendant 10 à 15 minutes, période durant laquelle les larves boivent. Les larves ayant alimenté peuvent être identifiées par la coloration verte du tube digestif antérieur résultant du colorant alimentaire vert. Transférez uniquement les larves ayant alimenté dans des gobelets en plastique d'une once, contenant du milieu, en plaçant une larve par gobelet.Après le transfert des larves, couvrez les godets avec des couvercles et incubez-les à 28 degrés Celsius pendant 24 heures après l'infection. Éliminez tous les godets contenant des larves mortes. Ces décès précoces sont probablement dus à des blessures causées par la manipulation.Lorsqu'on utilise ce bioessai pour déterminer la dose létale, les larves doivent être examinées toutes les deux à trois journées jusqu'à ce que les larves témoins non infectées et les larves traitées au virus ayant survécu aient purgé ou commencé à s'enfouir pour se nymphoser ; les larves infectées par le virus resteront à la surface du milieu de culture, puis mourront après quelques jours. Les larves mortes se racorniront parfois et deviendront noires ; celles décédant d'une infection deviennent essentiellement des poches de polyèdres, qui se dissoudront complètement. Si elles sont perturbées mécaniquement à ce stade, noter la mortalité larvaire pour chaque traitement.Les tests de concentration létale doivent être répétés trois ou quatre fois à des occasions distinctes. Utilisez 30 individus par dose pour chaque traitement viral ou contrôle. Utilisez un logiciel d'analyse probit approprié, tel que Polo ou SAS, pour calculer les valeurs de CL50, les intervalles de confiance à 95 % et les statistiques appropriées.Ce test d'alimentation par gouttelettes peut également être utilisé pour déterminer les valeurs de temps de survie ST50. Dans ce cas, la mortalité des larves est évaluée toutes les quatre à huit heures, avec des observations plus fréquentes. Si le taux de mortalité est élevé, les tests de temps de survie sont réalisés à l'aide d'une dose LC99 du virus ; les temps médians de survie et les limites de confiance à 95 % sont alors calculés à l'aide de l'estimateur de Kaplan-Meier, en utilisant un logiciel S-PLUS ou SAS.Maintenant que Harang vous a montré le bioessai par alimentation en gouttelettes, je vais vous présenter le bioessai avec le bouchon alimentaire. Dans ce bioessai, des larves de stade larvaire moyen à tardif sont nourries avec un bouchon alimentaire traité par une dose connue de virus afin de déterminer la dose létale ou DL 50. La veille de la réalisation de ce bioessai, retirez l'aliment du godet pour priver les larves de nourriture pendant la nuit.Cette étape augmentera la vitesse à laquelle les larves consomment le virus. Le lendemain, inoculez le cube de milieu alimentaire en préparant le milieu en le découpant en petits cubes d'environ deux millimètres cubes. Si les cubes de milieu sont trop petits, ils sécheront.Si les cubes de régime sont trop gros, les larves ne pourront pas consommer entièrement le cube de nourriture pendant la nuit. Ajoutez maintenant un à deux microlitres de suspension de polyèdres à chaque cube de régime. La suspension contient 4 % en volume de colorant alimentaire.Laisser la suspension pénétrer dans la nourriture pendant cinq à quinze minutes. Pensez également à préparer un cube de nourriture traité avec un virus factice comme témoin négatif. Ensuite, transférer un cube de nourriture vers chaque larve du quatrième stade larvaire dans chaque cupule.Ensuite, placer les gobelets dans l'incubateur toute la nuit à 28 degrés Celsius. Le jour suivant, éliminer toutes les larves qui n'ont pas complètement consommé le cube de régime. Puis ajouter un gros morceau de régime dans chaque gobelet destiné aux larves restantes. Maintenir les larves à 28 degrés Celsius, en ajoutant du régime supplémentaire si nécessaire, jusqu'à ce que les larves témoins et les larves infectées par le virus ayant survécu aient mangé ou commencé à se nymphoser.À ce stade, enregistrez le nombre d'insectes morts et celui des insectes survivants. Nous allons simplement vous montrer deux méthodes permettant d'infecter les insectes avec le virus back, à savoir le prélèvement sanguin et le prélèvement biopsique sur la plaque alimentaire. Lors de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les cadavres de larves tuées par le virus vao sont généralement fragiles et peuvent facilement se rompre, libérant ainsi le virus.Stérilisez donc les surfaces de travail et jetez les gants contaminés et les matériaux jetables de manière appropriée afin d'éviter toute contamination. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Dans cette vidéo, nous démontrons deux techniques micro-applicateur utilisé pour infecter des larves de lépidoptères avec des baculovirus afin de déterminer l'efficacité insecticide.

Les protocoles de micro-applicateur assistée Infection des larves de lépidoptères avec des baculovirus

La méthode décrite ici utilise l'injection directe de bactéries entomopathogènes dans le hémocèle...

L&#39;élevage et de l&#39;injection de<em&gt; Manduca sexta</emLes larves&gt; pour évaluer la virulence bactérienne

Orale et intra infection haemocolic des larves de la teigne de la cire...

L&#39;insecte<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un modèle d&#39;infection puissant pour étudier la pathogenèse bactérienne

Cette vidéo montre une méthode pour établir un modèle d’infection à Mycobacterium bovis chez les larves de la teigne de la cire, Galleria mellonella. Une souche bioluminescente de Mycobacterium bovis BCG est injectée dans l’hémolymphe de la larve pour établir l’infection, et la bioluminescence est mesurée à des intervalles prédéfinis pour étudier la progression de l’infection.

Technique permettant d’établir un modèle d’infection bactérienne chez les larves d’insectes

La mouche méditerranéenne des fruits (medfly) Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae) est un ravageur mondial de l’agriculture. Une meilleure compréhension de sa biologie est essentielle pour contrôler les populations de mouches et ainsi réduire l’impact économique. La micro-injection embryonnaire est un outil fondamental permettant à la fois la transformation de la lignée germinale et l’étude de la génétique inverse chez cette espèce.

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Ce protocole décrit un système d’expression de protéine induite par le choc de chaleur (système de pile à pDHsp/V5-His/sf9), qui peut être utilisé pour exprimant des protéines étrangères ou évaluation de l’activité anti-apoptotique de protéines étrangères potentiels et leur tronqué amine acides dans les cellules d’insectes.

Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine

Dans ce protocole, baculovirus est produit par transfection transitoire de baculovirus plasmide dans les cellules Sf9 et amplifié dans une culture en suspension sans sérum. Le surnageant est purifié par chromatographie d’affinité de l’héparine et davantage concentré par ultracentrifugation. Ce protocole est utile pour la production et la purification des baculovirus pour l’application de la thérapie génique.

Production et Purification de Baculovirus pour l’Application de la thérapie génique

Nous présentons ici un protocole pour produire chambre carboxylestérase mouche protéines in vitro avec un système d’expression baculovirus médiée par cellule insectes et plus tard fonctionnellement caractériser leurs rôles en métabolisant perméthrine, ainsi, conférant aux pyréthrinoïdes résistance en procédant à base de cellules MTT dosage et in vitro études métaboliques.

Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica

Nous présentons ici les protocoles utilisant les insectes cellulaire et baculovirus protein expression pour produire de grandes quantités de protéines végétales sécrétée de cristallisation de protéines. Un vecteur d’expression baculovirus a été modifié par GP67 ou peptide signal hemolin insectes pour expression plante de sécrétion des protéines dans des cellules d’insecte.

Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

Le système de vecteur d’expression de baculovirus (BEVS) est une plate-forme robuste pour le criblage d’expression et la production des méthyltransférases d’arginine de protéine (PRMTs) à utiliser pour des études biochimiques, biophysiques et structurelles. Des quantités milligrammes de matière peuvent être produites pour la majorité des PRT et d’autres protéines d’intérêt nécessitant une plate-forme d’expression eucaryote.

Production de protéines PRMT recombinantes à l’aide du système vectoriel d’expression du baculovirus

Les études structurales et biochimiques des transporteurs membranaires humains nécessitent des quantités de quelques milligrammes de protéines stables, intactes et homogènes. Nous décrivons ici des méthodes évolutives pour cribler, exprimer et purifier les transporteurs de solutés humains à l’aide de gènes optimisés pour les codons.

Expression et purification à haut débit de vecteurs de solutés humains pour des études structurales et biochimiques

Découvrez les techniques d'infection orale de larves de lépidoptères par baculovirus pour évaluer l'efficacité insecticide. Ce protocole utilise des bioessais par gouttelette et par cube de nourriture.

Protocoles pour l'infection orale des larves de lépidoptères avec des baculovirus

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