Protocoles pour l'infection orale des larves de lépidoptères avec des baculovirus

Dans cette vidéo, nous avons la démonstration des techniques d'infection orale avec des larves de lépidoptères baculovirus afin de déterminer l'efficacité insecticide.

Le virus Vao est couramment utilisé comme vecteur d’ADN utilisé en combinaison avec des lignées cellulaires d’insectes pour l’expression des protéines. Cependant, le fait que ce virus infecte efficacement les insectes avec des conséquences mortelles en fait également un agent insecticide efficace. Au Brésil, par exemple, le virus Balo de type sauvage est appliqué sur plus de 1 million d’hectares de cultures de soja chaque année pour lutter contre la chenille du haricot mascate afin d’améliorer leur efficacité insecticide, les virus Balo ont été génétiquement modifiés avec des gènes codant pour des toxines spécifiques aux insectes qui sont actives dans l’HemosIL de l’insecte.

Dans cette vidéo, nous démontrons des méthodes d’infection buccale des larves de lépidoptères par le virus bacao afin d’analyser l’efficacité insecticide. Bonjour, je suis du laboratoire d’ossage aveugle du département d’ophtalmologie et de l’Université d’État de l’Iowa, et je suis Wendy Sparks également du laboratoire de désossage. Aujourd’hui, nous allons vous montrer deux procédures pour l’infection par le virus VA du lter et des larves.

Tout d’abord, Harran vous montrera comment infecter les larves de nouveau-nés à l’aide d’un test biologique d’alimentation en gouttelettes. Ensuite, je vous montrerai comment infecter des larves du milieu au dernier stade à l’aide d’un biotest sanguin alimentaire. Alors commençons.

Les essais biologiques d’alimentation par gouttelettes peuvent être utilisés pour déterminer la dose létale d’abacavir et la survie. Temps des larves infectées par le virus balo. Les larves de premier stade ou les larves nouveau-nées sont généralement utilisées pour cet essai.

Avant de commencer, assurez-vous d’avoir des tasses diététiques avec le régime approprié à portée de main. Préparez également le virus approprié Les dilutions comprennent un colorant alimentaire vert à une concentration de 4 % en volume. Afin de déterminer la concentration virale létale, la dilution doit donner une plage de mortalité comprise entre un et 99 %Des essais biologiques préliminaires peuvent être nécessaires pour déterminer une plage appropriée de concentrations virales après avoir tourbillonné le tube pour empêcher la sédimentation des polyèdres, faire deux cercles concentriques de petites gouttelettes de la solution virale dans une boîte de Pétri de 60 millimètres.

Pour chaque concentration de virus utilisée, pensez à mettre également en place un témoin négatif de l’infection fictive. Ensuite, transférez 25 à 30 larves de nouveau-nés au milieu des cercles concentriques à l’aide d’un pinceau stérile. Placez le couvercle sur le plat et fermez-le avec du paraform pour empêcher les larves de s’échapper.

Idéalement, utilisez différents pinceaux pour le transfert à chaque type de virus afin d’éviter la contamination entre les traitements. Laissez le plat reposer à température ambiante pendant 10 à 15 minutes, pendant lesquelles les larves boivent. Les larves de solution qui se sont nourries peuvent être identifiées par la coloration verte de l’intestin antérieur résultant du colorant alimentaire vert ne transfère que les larves qui se sont nourries dans des gobelets en plastique d’une once, qui contiennent un transfert de régime une larve par tasse.

Après avoir transféré les larves, couvrez les gobelets avec des couvercles et incubez à 28 degrés Celsius 24 heures après l’infection. Éliminez toutes les gobelets contenant des larves mortes. Ces décès prématurés résultent probablement de blessures causées par la manipulation.

Lors de l’utilisation de cet essai biologique pour déterminer la dose létale, les larves doivent être vérifiées tous les deux à trois jours jusqu’à ce que les larves infectées simulées et les larves survivantes traitées au virus se soient purifiées ou aient commencé à emprunter afin de nymphoser. Les larves infectées par le virus resteront sur le dessus de la nourriture et mourront après quelques jours. Les larves mortes deviennent parfois noires et deviennent essentiellement des sacs de polyèdres, qui se dissolvent complètement. S’ils sont perturbés mécaniquement à ce moment-là, notez la mortalité larvaire dans chaque traitement.

essais biologiques sur la concentration létale doivent être répétés trois ou quatre fois à des occasions distinctes. Utiliser 30 personnes par dose pour chaque traitement antiviral ou de contrôle. Utilisez un programme d’analyse d’homologation approprié tel que polo ou SAS pour calculer les valeurs lc 50, les intervalles de confiance à 95 % et les statistiques appropriées.

Ce test d’alimentation en gouttelettes peut également être utilisé pour déterminer les valeurs de temps de survie ST 50. Dans ce cas, la mortalité des larves est notée toutes les quatre à huit heures avec des observations plus fréquentes. Si le taux de mortalité est élevé, le temps de survie est élevé, des essais biologiques sont effectués à l’aide d’une dose de lc 99 du temps de survie médian du virus, et les limites de confiance à 95 % sont calculées à l’aide de l’estimateur de Kaplan Mayer à l’aide d’un programme s plus ou SAS.

Maintenant que Harang vous a montré l’essai biologique sur l’alimentation en gouttelettes, je vais vous montrer l’essai biologique sur l’alimentation en gouttelettes. Les larves du stade intermédiaire ou tardif sont nourries avec un bouchon alimentaire traité avec une dose connue de virus afin de déterminer la dose létale ou DL 50 la veille de la réalisation de cet essai. Retirez le régime de la tasse pour affamer les larves pendant la nuit.

Cette étape permettra d’augmenter la vitesse à laquelle les larves consomment le virus. Cube de régime inoculé le lendemain, préparez le régime en le coupant en petits cubes d’environ deux millimètres cubes. Si les cubes de régime sont trop petits, ils se dessècheront.

Si les cubes de régime sont trop gros, les larves ne pourront pas consommer tout le cube de régime pendant la nuit. Ajoutez maintenant un à deux microlitres de suspension de polyèdres à chaque cube de régime. La suspension contient 4 % de colorant alimentaire en volume.

Laissez la suspension s’imprégner dans l’alimentation pendant cinq à 15 minutes. N’oubliez pas de préparer également un cube de régime simulé traité contre le virus comme contrôle négatif. Ensuite, transférez un cube de régime à chaque larve du quatrième stade dans chaque tasse.

Placez ensuite les tasses dans l’incubateur pendant la nuit à 28 degrés Celsius le lendemain, jetez toutes les larves qui n’ont pas complètement mangé le cube de régime. Ajoutez ensuite un gros morceau de régime dans chaque tasse pour les larves restantes. Maintenir les larves à 28 degrés Celsius, en ajoutant un régime supplémentaire au besoin jusqu’à ce que les larves infectées et les larves infectées par le virus survivantes aient commencé à se nymphoser.

À ce moment, notez le nombre d’insectes morts et survivants. Nous allons juste vous montrer deux méthodes pour infecter les insectes avec le virus du dos, la saignée, la biopsie alimentaire et la biopsie de la plaque alimentaire. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les larves tuées par le virus Vao sont généralement fragiles et peuvent facilement se rompre, libérant le virus.

Stérilisez donc les surfaces de travail et éliminez les gants contaminés et les matériaux jetables de manière appropriée pour éviter toute contamination. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.