Les protocoles de micro-applicateur assistée Infection des larves de lépidoptères avec des baculovirus

Alors que le virus baccala spécifique aux arthropodes est utilisé comme outil de recherche standard pour les systèmes d’expression des protéines eucaryotes, il est également développé comme un agent insecticide sans danger pour l’environnement, qui peut tuer les insectes herbivores tels que les lépidoptères dans la nature. Les larves de lépidoptères sont infectées par les virus baccala lorsqu’elles mangent du feuillage infecté. Les larves ou la chenille ingèrent le virus baccala sous une forme connue sous le nom de polyèdre, qui est un complexe de particules virales emballées dans une grande structure protéique cristalline qui protège le virus de la dessiccation.

Une fois que la larve est infectée, le virus disséminé l’infection au sein de l’insecte. Le virus détourne la machinerie de synthèse des acides nucléiques et des protéines de l’hôte pour produire plus de virus et de polyèdres. Finalement, les larves sont si complètement infectées par le virus qu’elles se dissolvent dans un suintement désordonné de polyèdres qui s’égoutte sur les surfaces des plantes mangées par l’insecte, puis le cycle recommence afin de déterminer l’efficacité insecticide d’un Baca particulier.

Les techniques de micro-applicateur de souche Avir et les essais biologiques peuvent être combinés. Les larves de Leid dorin peuvent être infectées par injection du virus buté directement dans l’HemosIL ou dans la cavité corporelle et les taux de mortalité peuvent être évalués. De plus, les larves peuvent être infectées par des polyèdres à l’aide d’une injection assistée par micro-applicateur oral et le moment de l’infection de l’intestin et d’autres tissus peut être analysé.

Bonjour, je suis Wendy Sparks dans le laboratoire de Brian e désossage au département d’entomologie de l’Université d’État de l’Iowa Et je suis aussi de désossage snap. Aujourd’hui, nous allons vous montrer deux procédures pour infecter le DI du conduit de laboratoire avec le virus de l’arriéré. Les deux méthodes utilisent un micro-applicateur.

Tout d’abord, je vais vous montrer l’utilisation d’un micro-applicateur pour administrer le virus corporel dans le corps dans le heni à travers le prol. Ensuite, lorsque vous montrez, vous utilisez le micro-applicateur pour livrer un en-tête poly dans la protection médiane à travers la souris. Alors commençons.

Lorsqu’ils sont développés à des fins insecticides, les virus balo contiennent généralement le gène polyèdre pour faciliter l’infection orale des larves de ravageurs. Cependant, à l’occasion, il existe des raisons de tester un virus baccala polyèdre négatif pour des effets insecticides potentiels ou pour contourner l’intestin d’un insecte. Dans ce cas, l’injection du virus buté à l’aide d’un micro-applicateur peut être effectuée pour infecter les larves avant de commencer le test.

Le titre de la matière première du virus buté doit être déterminé à l’aide d’un dosage sur plaque ou d’un test de dilution du point final. Pour les expériences physiologiques, des injections de cinq fois 10 dans le quatrième PFU par cinquième stade H VNS seraient typiques. Pour commencer cet essai biologique, chargez chaque dilution de virus à section jointe dans une seringue en plastique d’un cc à hercule avec une pointe d’aiguille pointue de calibre 28,5 ou 32.

Généralement un à trois microlitres de solution virale aboutée. Avec un titre de 10 à la septième, moins 10 à la huitième par millilitre peut être utilisé pour chaque larve, de sorte que le chargement de 300 à 500 microlitres dans la seringue est suffisant pour la plupart des usages. Ensuite, chassez les bulles d’air de la seringue en tenant la seringue à la verticale pour amener l’air à la pointe de l’aiguille et distribuer.

Fixez ensuite la seringue sur le tube de support de la seringue. Réglez maintenant le volume sur 1,0 microlitre. Pour chaque gouttelette sur l’unité de commande du microprocesseur du micro-applicateur, calibrez d’abord l’unité de commande pour vous assurer que le bon volume est distribué, la vitesse à laquelle la gouttelette est distribuée peut être réglée sur une échelle de zéro à neuf.

Une plage de zéro à un est couramment utilisée. Appuyez sur la pédale pour vous assurer que la solution est distribuée de manière appropriée. N’oubliez pas que si une trop grande quantité de solution est distribuée ou si l’application est trop lente, les paramètres de volume et de vitesse peuvent être ajustés jusqu’à ce que le bon volume de solution soit appliqué au bon taux.

Je suis maintenant prêt à commencer l’injection pour l’infection à H. VNS. Au début du cinquième stade, les larves sont généralement injectées, la plus grande taille des derniers stades facilite le processus d’injection. Insérez la pointe de l’aiguille à travers la plana de l’une des jambes professionnelles et dans la cavité corporelle.

Notez que lorsque la pointe de l’aiguille s’insère dans le prolé, changez la position du corps larvaire Pour éviter d’endommager l’intestin et la paroi du corps, appuyez maintenant quatre fois sur l’interrupteur au pied pour administrer quatre microlitres de la solution virale dans le sceau hémologique. Une fois les injections terminées, retournez toutes les larves dans l’incubateur à 28 degrés Celsius. Vérifiez fréquemment qu’il n’y a pas de larves mortes et assurez-vous qu’il existe un régime alimentaire adéquat pour les larves survivantes.

Même si les derniers stades ne meurent pas d’une lésion de la cuticule résultant d’une injection, les larves doivent toujours être contrôlées 24 heures après l’injection en cas de dommages à l’intestin, qui pourraient résulter d’une infection bactérienne. Cette mortalité précoce est à exclure de l’analyse des données. Si vous utilisez l’essai biologique assisté par micro-applicateur avec un virus à tige pour des essais biologiques à concentration létale, l’essai biologique doit être répété trois ou quatre fois à des occasions distinctes.

Utiliser 30 personnes par dose pour chaque traitement antiviral ou de contrôle. Utilisez un programme d’analyse d’homologation approprié tel que polo ou SAS pour calculer les valeurs lc 50, les intervalles de confiance à 95 % et les statistiques appropriées. Cet essai biologique peut également être utilisé pour déterminer les valeurs de temps de survie ST 50 après l’inoculation d’une dose fixe de virus.

Dans ce cas, la mortalité des larves est notée toutes les quatre à huit heures avec des observations plus fréquentes. Si le taux de mortalité est élevé, les temps médians de survie dans les limites de confiance à 95 % sont calculés à l’aide de l’estimateur de Kaplan Meyer à l’aide d’un programme s plus ou SAS. Maintenant que Harran vous a montré le bioessai assisté par micro-applicateur à l’aide du virus abouté.

Je vais vous montrer le test. L’inoculation orale de polyèdres directement dans l’intestin de l’insecte est utilisée lorsque le moment exact de l’infection est critique. Par exemple, lorsque vous surveillez la façon dont le virus se propage dans l’insecte pour commencer cet essai, suspendez les polyèdres dans une solution neutre de trois à deux de glycérine et d’eau de 10 à 300.

Les polyèdres pourraient être utilisés pour la quatrième tige, par exemple. Ensuite, chargez cette solution dans une seringue à tuberculine CC en plastique ou en verre avec une aiguille à pointe émoussée de calibre 32. Placez la seringue sur le tube de support du micro-applicateur en regardant au microscope.

Tenez le quatrième ou le cinquième dans la larve étoilée, insérez l’aiguille dans la bouche et dans la région antérieure de l’intestin moyen, puis libérez les polyèdres. Cette technique nécessite un peu de pratique. Tout d’abord, il peut être délicat de tenir les larves avec des gants sans les écraser.

Deuxièmement, il faut un peu de pratique pour faire passer l’aiguille au-delà des pièces buccales. Nous vous recommandons de vous entraîner à inoculer environ 30 larves avec du PBS. S’il vous arrive de percer l’intestin, ce sera évident car les larves se sont mélangées et sont devenues noires assez rapidement.

Encore une fois, parce que l’inoculation orale assistée par micro-applicateur fournit le moment exact de l’infection, cette méthode est plus utile pour les expériences dans lesquelles le temps d’infection est important pour déterminer comment le virus se propage dans l’insecte. Par exemple, les virus exprimant la bêta-galactoses dase peuvent être inoculés par voie orale dans des larves, qui sont ensuite disséquées à divers moments pour déterminer quels tissus sont infectés lorsque nous allons simplement vous montrer deux vaisseaux assistés par micro-applicateur pour l’infection. L’amour des insectes avec vir, dont le premier était l’inoculation directe via le pro Legg du virus butted, ce qui vous permet de contourner la physiologie intestinale et d’évaluer la létalité et le temps létal du virus qui vous intéresse.

La deuxième technique était l’inoculation directe dans l’intestin moyen à l’aide de polyèdres. Cela vous permet d’administrer une dose très précise directement dans l’intestin moyen, ainsi que de contrôler le moment très précis de l’événement. Ensuite, vous pouvez également étudier la mortalité et d’autres phénotypes du virus.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les larves tuées par le virus des cadavres baula sont généralement fragiles et peuvent facilement se rompre, libérant le virus. Stérilisez donc les surfaces de travail et éliminez les gants contaminés et les matériaux jetables de manière appropriée pour éviter toute contamination. Donc c’est tout.

Merci de votre attention. Bonne chance dans votre expérience.