Name: Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Apprenez à mesurer l'activité des protéases par dosage colorimétrique de la tyrosine libérée après digestion de la caséine. Cette méthode standardisée assure le contrôle qualité des préparations enzymatiques en laboratoire.

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Avant de commencer l&#39;essai, nous avons besoin pour s&#39;assurer que les réactifs suivants sont correctement préparées: <ol><li> Un tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 7,5. Préparer en utilisant 11,4 mg / ml de phosphate de potassium dibasique, trihydraté dans l&#39;eau purifiée et d&#39;ajuster le pH avec HCl 1M. Cette solution est placée à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Une solution de caséine à 0,65% en poids / volume, préparé en mélangeant 6,5 mg / ml de caséine dans le tampon phosphate de potassium 50 mM. Progressivement augmenté la température de la solution en agitant doucement à 80-85 ° C pendant environ 10 minutes jusqu&#39;à obtenir une dispersion homogène est atteint. Il est très important de ne pas faire bouillir la solution. Le pH est ensuite ajusté, si nécessaire avec NaOH et HCl. </li><li> Une solution 110 mM d&#39;acide trichloracétique, préparé en diluant un stock de 01h55 6.1N avec de l&#39;eau purifiée. L&#39;acide trichloracétique est un acide fort et doit être manipulé avec soin. </li><li> 0,5 mM Folin &amp; Ciolcaltea, ou réactif de phénol de Folin, qui est la solution qui va réagir avec la tyrosine à générer un changement de couleur mesurables qui seront directement liés à l&#39;activité des protéases. Réactif de Folin phénol est un acide et doit être manipulé avec soin. </li><li> Une solution 500 mM Sodium Carbonate, préparés en utilisant 53 mg / ml de carbonate de sodium dans l&#39;eau purifiée anyhydrous. Une solution de diluant enzyme, qui se compose de 10 mM de tampon acétate de sodium avec de l&#39;acétate de calcium 5mM, pH 7,5, à 37 ° C. Cette solution est ce que nous utilisons pour dissoudre les échantillons solides ou protéase solutions diluées enzyme. </li><li> 1,1 mM de L-tyrosine solution stock standard. Préparé en utilisant 0,2 mg / ml de L-tyrosine dans l&#39;eau purifiée et chauffée doucement jusqu&#39;à ce que la tyrosine se dissout. Comme avec la caséine, ne pas faire bouillir cette solution. Autoriser la norme de L-tyrosine refroidir à température ambiante. Cette solution sera diluée davantage pour faire de notre courbe standard. </li><li> Solution de protéase. Immédiatement avant utilisation, dissoudre dans une solution de protéase diluant d&#39;enzyme préparée à l&#39;étape 6. </li></ol> Si nécessaire, utilisez un échantillon de protéase solide de l&#39;activité prédéterminé, qui est dissous en utilisant le diluant d&#39;enzymes à 0,1-0,2 unités / ml. Cette solution sert de contrôle positif pour le test de contrôle qualité et la validation des calculs nous allons effectuer pour déterminer l&#39;activité enzymatique. Mise en place du dosage de la protéase et des courbes standard <ol><li> Pour commencer ce test, trouver des flacons adaptés qui contiendra environ 15 ml. Pour chaque enzyme qui seront testés, 4 flacons sont nécessaires. Un flacon sera utilisé comme un blanc, et trois autres seront utilisés pour l&#39;activité de dosage de trois dilutions de la protéase. Trois dilutions sont utiles lors de la vérification des calculs finale contre l&#39;autre. <ol><li> Pour chaque série de quatre flacons, ajoutez 5 ml de notre solution de caséine à 0,65%. Qu&#39;ils s&#39;équilibrer dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant environ 5 minutes. </li><li> Ajouter des volumes variables de solution enzymatique qui sera testé à trois des fioles d&#39;échantillon de test, mais pas le vide. Mélanger en remuant et laisser incuber à 37 ° C pendant exactement dix minutes. L&#39;activité de la protéase et la libération de la tyrosine consécutifs pendant ce temps d&#39;incubation est de ce qui sera mesuré et comparé entre les échantillons de test. </li></ol></li><li> Après cette incubation de 10 minutes, ajouter les 5 ml du réactif TCA dans chaque tube pour arrêter la réaction. Ensuite, ajoutez un volume approprié de solution d&#39;enzyme dans chaque tube, même le blanc, de sorte que le volume final de solution d&#39;enzyme dans chaque tube est de 1 ml. Ceci est fait pour rendre compte de la valeur d&#39;absorption de l&#39;enzyme elle-même et pour s&#39;assurer que le volume final de chaque tube est égal. Incuber les solutions à 37 ° C pendant 30 minutes. Pendant cette incubation de 30 minutes, vous pouvez configurer votre tyrosine dilutions standard. Utilisez 6 flacons DRAM (DRAM flacons peuvent être remplacés par des tubes en polypropylène) qui peut facilement contenir 8 ml. Pour les six fioles, ajouter les 1,1 mM tyrosine solutions de stock standard avec les volumes suivants de la MLS: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Ne pas ajouter de toute norme de tyrosine à la vierge. Normes inférieures peuvent être nécessaires pour des échantillons de test impurs qui donneront changement de couleur peu. Une fois la solution de tyrosine standard a été ajouté, ajouter un volume approprié d&#39;eau purifiée pour chacune des normes pour porter le volume à 2 ml. </li><li> Après l&#39;incubation de 30 minutes, le filtre de chacune des solutions de test et le blanc en utilisant une seringue de 0,45 um polyéthersulfone filtre. La filtration est nécessaire pour éliminer toute insolubles à partir des échantillons. <ol><li> Ajouter la filtration 2 ml des échantillons de test et vierge filtrat à 4 flacons de DRAM qui peut contenir au moins 8 ml. Le même type de flacon dans lequel les normes ont été préparées peuvent être utilisées. </li><li> Pour tous les flacons contenant les normes et standards vierge, ajoutez 5 ml de carbonate de sodium. Pour de meilleurs résultats, ajouter 1 ml de réactif de Folin a tout de suite après. </li><li> Ajouter du carbonate de sodium à réglementer toute baisse de pH créé par l&#39;ajout du réactif de Folin l&#39;a. </li><li> Ajouter carbonate de sodium pour les échantillons à tester et TESvierge t. Ces solutions deviennent troubles après l&#39;ajout de carbonate de sodium. Ajouter le réactif de Folin l&#39;, qui va réagir principalement avec la tyrosine libre. </li><li> Mélangez les flacons dram par tourbillonnement et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes. </li></ol> Après cette incubation, vous devriez remarquer que les normes ont une gradation de couleur en corrélation avec la quantité de tyrosine ajoutée; concentrations les plus élevées de la tyrosine sombres apparaissent. Vous pouvez également changer la couleur préavis appréciable dans nos échantillons de test. 2mls de ces solutions sont filtrées à l&#39;aide de 0,45 um polyéthersulfone filtre seringue dans des cuvettes appropriés. Maintenant que le dosage est effectué, vous pouvez procéder au spectrophotomètre pour enregistrer nos valeurs d&#39;absorbance. </li></ol> De mesurer l&#39;absorbance et de calculer l&#39;activité enzymatique <ol><li> L&#39;absorbance des échantillons est mesurée par un spectrophotomètre en utilisant une longueur d&#39;onde de 660nm. Le trajet de la lumière est réglée à 1cm. Enregistrer les valeurs d&#39;absorbance pour les normes, les standards vierge, les échantillons d&#39;essai différentes, et vierge de test. Une fois toutes les données ont été recueillies, la courbe standard peut être créé. Afin de générer la courbe, la différence d&#39;absorbance entre le blanc standard et standard doit être calculé. Il s&#39;agit de la valeur d&#39;absorbance due à la quantité de tyrosine dans les solutions standard. Après ce calcul simple, créer la courbe standard à l&#39;aide d&#39;un programme graphique pour tracer le changement d&#39;absorbance de nos normes sur l&#39;axe Y, par rapport au montant en micromoles pour chacun de nos cinq normes sur l&#39;axe X. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume de la norme Tyrosine </th><th style="text-align:center"> Tyrosine umoles </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Après les points de données ont été entrées, générer une ligne de meilleur ajustement et l&#39;équation de pente correspondant. Trouver le changement d&#39;absorbance dans les échantillons de test en calculant la différence entre l&#39;absorbance de l&#39;échantillon de test et l&#39;absorbance du blanc d&#39;essai. Insertion de la valeur d&#39;absorbance de l&#39;un des échantillons d&#39;essai dans l&#39;équation de pente et la résolution de se traduira par la micromoles de tyrosine libérée au cours de cette réaction protéolytique particulière. Pour obtenir de l&#39;activité de l&#39;enzyme en unités par / ml, effectuer le calcul suivant: (Umole équivalents tyrosine libérée) x (11) Unités / ml = Enzyme __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = volume total (en millilitres) de dosage 10 = Temps d&#39;essai (en minutes) selon la définition Unité 1 = Volume d&#39;enzyme (en millilitres) d&#39;enzyme utilisée 2 = Volume (en millilitres) utilisées dans la détermination colorimétrique Prenez le nombre d&#39;équivalents micromoles tyrosine libérée obtenus à partir de l&#39;équation de pente et le multiplier par le volume total de l&#39;essai dans la MLS, qui dans notre cas est 11mls. Diviser cette valeur par trois autres quantités: le temps de l&#39;essai, ce qui nous avons couru pendant 10 minutes, le volume d&#39;enzyme utilisé dans le dosage, qui était variée (nous allons utiliser 1ml), le volume de millilitres utilisés dans la détection colorimétrique, ce qui peut diffèrent en fonction de votre cuvette. Nous avons utilisé 2 ml. </li><li> Micromoles de la tyrosine, divisé par le temps en minutes rendements mesure de l&#39;activité de la protéase appelée «unités». Nous pouvons annuler les unités de mesure de volume dans le numérateur et le dénominateur, laissant un measurment de l&#39;activité enzymatique en termes d&#39;unités / ml. Afin de déterminer l&#39;activité dans un échantillon de protéase solides diluées dans du diluant d&#39;enzymes, nous divisons notre activité en unités / ml par la concentration de solides utilisés dans cet essai à l&#39;origine en mg / ml., Nous laissant avec l&#39;activité en termes d&#39;unités / mg . Unités / ml enzyme Unités / mg de solide = _____________________ mg de solide / enzyme ml </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

Nous venons de vous montrer comment analyser l&#39;activité de la protéase à l&#39;aide de Sigma test universelle activité de la protéase. En outre, ce test est utile pour s&#39;assurer que nos protéases ont déterminé avec précision l&#39;activité avant de les recevoir pour vos expériences. Comme vous l&#39;avez vu, lors de cette procédure, il est d&#39;une importance primordiale à retenir la chaleur à la fois de la caséine et des solutions de tyrosine lentement et de ne pas les faire bouillir. Aussi, il est essentiel de préparer les blancs différents pour les deux normes de votre et pour chaque échantillon d&#39;essai que vous avez.

<table><tbody><tr><td>Protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium, dibasique, trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Caséine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloroacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Réactif phénolique de Folin &amp;amp; Ciocalteu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de sodium, anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium, trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, base libre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'analyse des protéases</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détection fluorescente des protéases</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma non spécifiques assay activité de la protéase - caséine comme substrat

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Les protéases casser les liaisons peptidiques. Dans le laboratoire, il est souvent nécessaire de mesurer et / ou comparer l&#39;activité des protéases. Sigma non spécifiques dosage de l&#39;activité de la protéase peut être utilisé comme une procédure normalisée pour déterminer l&#39;activité des protéases, qui est ce que nous faisons lors de nos procédures de contrôle qualité. Dans cet essai, la caséine agit comme un substrat. Lorsque la protéase nous testons digère la caséine, l&#39;acide aminé tyrosine est libéré avec d&#39;autres acides aminés et fragments peptidiques. Réactif de Folin et Ciocalteus phénol, ou Folin réagit principalement avec la tyrosine libre de produire un chromophore de couleur bleue, qui est quantifiable et mesurée comme une valeur d&#39;absorbance sur le spectrophotomètre. Le plus tyrosine qui est libérée à partir de caséine, plus les chromophores sont générés et le plus fort de l&#39;activité de la protéase. Les valeurs d&#39;absorbance généré par l&#39;activité de la protéase sont comparées à une courbe standard, qui est généré par la réaction des quantités connues de la tyrosine avec le réactif CF de corréler les changements d&#39;absorbance avec le montant de la tyrosine en micromoles. De la courbe standard de l&#39;activité de la protéase échantillons peut être déterminé en termes de parts, qui est le montant en micromoles d&#39;équivalents tyrosine libéré de la caséine par minute. Pour voir cet article en chinois, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">cliquez ici</a>

Les protéases casser les liaisons peptidiques. Dans le laboratoire, il est souvent nécessaire de mesurer et / ou comparer l&#39;activité des protéases. Sigma non spécifiques dosage de l&#39;activité de la protéase peut être utilisé comme une procédure normalisée pour déterminer l&#39;activité des protéases.

Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat

Les protéases rompent les liaisons peptidiques. En laboratoire, il est souvent nécessaire de mesurer et/ou de comparer l'activité des protéases. La protéase non spécifique de Sigma...

Les protéases rompent les liaisons peptidiques en laboratoire. Il est souvent nécessaire de mesurer ou de comparer l'activité des protéases Sigma. Le dosage universel de l'activité protéolytique peut être utilisé comme procédure normalisée pour déterminer l'activité des protéases, ce que nous faisons lors de nos procédures de contrôle qualité.Dans ce dosage, la casianine agit comme substrat lorsque la protéase que nous testons digère la casianine. L'acide aminé tyrosine est libéré avec d'autres acides aminés et fragments peptidiques. La tyrosine libre réagit ensuite avec le phénol de la réactif de Folin-Ciocalteu ou réactif de Folin pour produire un chromophore bleu, qui est quantifiable et mesuré sous forme de valeur d'absorbance sur le spectrophotomètre.Plus la tyrosine libérée à partir de la caséine est importante, plus les chromophores sont générés et plus l'activité de la protéase est élevée. Les valeurs d'absorbance produites par l'activité de la protéase sont comparées à une courbe standard établie en faisant réagir des quantités connues de tyrosine avec le réactif de Folin-Ciocalteu (FC), afin de corréler les variations d'absorbance. À partir de la quantité de tyrosine, exprimée en micromoles, obtenue grâce à la courbe standard, l'activité des échantillons de protéase peut être déterminée en unités, correspondant à la quantité de micromoles d'équivalent tyrosine libérée à partir de la caséine par minute. Bonjour, je m'appelle Carrie Cup Vineyard et je suis scientifique au sein de notre installation Sigma Aldridge DeKalb ici à St. Louis, Missouri.Aujourd'hui, je vais vous montrer une méthode universellement applicable pour tester l'activité protéasique chez Sigma Aldridge. Nous utilisons principalement ce dosage dans notre service de contrôle qualité afin de garantir que notre protéase possède une activité suffisante avant de vous l'expédier directement à votre laboratoire. Avant de commencer le dosage, nous devons nous assurer que les réactifs suivants sont correctement préparés.Un tampon phosphate de potassium à 50 millimolaire, pH 7,5. La solution est placée à 37 degrés Celsius avant utilisation, une solution de kasian à 0,65 % poids/volume préparée en mélangeant 6,5 milligrammes par millilitre dans un litre. La température de la solution est progressivement augmentée avec une agitation douce à 80 à 85 degrés Celsius pendant environ 10 minutes jusqu'à l'obtention d'une dispersion homogène.Il est très important de ne pas faire bouillir la solution. Le pH est ensuite ajusté si nécessaire à l'aide d'hydroxyde de sodium et d'acide chlorhydrique. Une solution d'acide trichloroacétique à 110 millimolaire, préparée en diluant un stock à 6,1 normal dans un rapport de 1 à 55 avec de l'eau purifiée à 0,5 millimolaire, contient des sels de fer ou du réactif au phénol, qui est la solution qui réagira avec la tyrosine pour produire un changement de couleur mesurable.Cela sera directement lié à l'activité des protéases. Une solution de carbonate de sodium à 500 millimolaire préparée à l'aide de 53 milligrammes par millilitre de carbonate de sodium anhydre dans de l'eau purifiée, et une solution diluante d'enzyme, constituée d'un tampon d'acétate de sodium à 10 millimolaire avec 5 millimolaire de calcium à pH 7,5 à 37 degrés Celsius. Cette solution est celle que nous utilisons pour dissoudre les échantillons de protéase solides ou diluer les solutions enzymatiques.La solution mère normalisée de L-tyrosine, qui doit avoir une concentration initiale de 1,1 millimolaire, soit une solution de 0,2 milligramme par millilitre de L-tyrosine, est préparée dans de l'eau purifiée et chauffée doucement jusqu'à dissolution complète de la tyrosine. Comme pour la caséine, ne pas faire bouillir cette solution. Laisser la solution normalisée de L-tyrosine refroidir à température ambiante.Cette solution sera davantage diluée pour établir notre courbe standard si nécessaire, à l’aide d’un échantillon solide de protéase dont l’activité est prédéterminée et qui est dissous dans un diluant d’enzyme à raison de 0,1 à 0,2 unité par millilitre. Cette solution sert de témoin positif pour le test de contrôle qualité, et de validation pour les calculs que nous effectuerons afin de déterminer l’activité enzymatique. Maintenant que nous avons préparé nos réactifs et qu’ils sont tous à la température appropriée, nous allons commencer notre dosage de la protéase.Pour commencer ce dosage, choisissez des vials appropriés pouvant contenir environ 15 millilitres. Pour chaque enzyme que vous allez tester, vous aurez besoin de quatre vials. Un vial sera utilisé comme blanc, et les trois autres serviront à doser l'activité de trois.La dilution de la protéase en trois dilutions est utile lors de la vérification croisée de nos calculs finaux. Ajouter à chaque ensemble de quatre flacons cinq millilitres de notre solution de kasaïne à 0,65 % et les laisser équilibrer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes. Ensuite, ajouter des concentrations variables de notre solution d'enzyme à trois des flacons d'échantillon test, mais pas au témoin. Les mélanger par agitation circulaire et incuber à 37 degrés Celsius pendant exactement 10 minutes.L'activité protéasique et la libération consécutive de tyrosine au cours de cette période d'incubation seront mesurées et comparées entre nos échantillons test. Après cette incubation de 10 minutes, ajoutez cinq millilitres du réactif TCA dans chaque tube. Ensuite, un volume approprié de solution enzymatique est ajouté à chaque tube, y compris au témoin, de sorte que le volume final de solution enzymatique dans chaque tube soit d'un millilitre.Cela permet de tenir compte de la valeur d'absorbance de l'enzyme elle-même. Incubez maintenant les solutions à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant cette incubation de 30 minutes, vous pouvez préparer les dilutions de la courbe étalon de tyrosine, qui s'effectue à l'aide de six vials DR.Cela peut facilement contenir huit millilitres répartis entre les six vials. La solution mère de tyrosine à 1,1 millimolaire est ajoutée aux volumes suivants, en millilitres : 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 et 0,5. N'ajoutez aucune solution mère de tyrosine au témoin.Des normes inférieures peuvent être nécessaires pour les échantillons de test IPU qui présenteront une faible variation de couleur. Une fois la solution standard de tyrosine ajoutée, ajouter un volume approprié d'eau purifiée à chacun des standards afin d'ajuster le volume à deux millilitres. Après l'incubation, filtrer chacune des solutions d'essai ainsi que le témoin.À l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micron, deux millilitres des échantillons d’essai et du filtrat témoin sont ensuite ajoutés à quatre fioles DR pouvant contenir au moins huit millilitres. Vous pouvez utiliser le même type de fiole que celui utilisé pour préparer les étalons. Dans toutes les fioles contenant les étalons et l’étalon témoin, ajoutez cinq millilitres de carbonate de sodium, puis, pour de meilleurs résultats, ajoutez immédiatement après le réactif tombé. Ajoutez ensuite du carbonate de sodium à vos échantillons d’essai et au témoin d’essai. Vous remarquerez que ces solutions deviennent troubles après l’ajout du carbonate de sodium.Ensuite, le réactif précipité est ajouté, qui réagira avec la tyrosine libre. Les vials DRAM sont alors mélangés par agitation en vortex et incubés à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes après cette incubation. Vous devriez observer que les témoins présentent une gradation de couleur corrélant avec la quantité de tyrosine ajoutée, les concentrations les plus élevées de tyrosine apparaissant en teinte la plus foncée.Vous pouvez également observer un changement de couleur appréciable dans nos échantillons de test. Deux millilitres de ces solutions sont filtrés à l'aide d'un filtre à seringue de 0,45 micron et d'une cuvette appropriée. Maintenant que notre dosage est terminé, passons au spectrophotomètre et enregistrons nos valeurs d'absorbance.L'absorbance de nos échantillons est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre utilisant une longueur d'onde de 660 nanomètres. Le trajet optique est réglé à un centimètre ; enregistrez les valeurs d'absorbance pour les étalons, le témoin zéro, les différents échantillons d'essai et le témoin d'essai. Une fois toutes les données recueillies, nous sommes prêts à établir notre courbe d'étalonnage.Afin de générer la courbe, il faut calculer la différence d'absorbance entre l'étalon et le blanc de l'étalon. Cette valeur d'absorbance correspond à celle attribuable à la quantité de tyrosine présente dans les solutions étalons. Après ce calcul simple, nous établissons notre courbe standard en portant sur l'axe des Y la variation d'absorbance de nos étalons, et sur l'axe des X la quantité, en micromoles, pour chacun de nos cinq étalons.Une fois que nous avons saisi nos points de données et généré une droite de régression, nous déterminons la variation d'absorbance dans nos échantillons-tests en calculant la différence entre l'absorbance de l'échantillon-test et celle du témoin-test. En consultant notre courbe standard, nous repérons sur l'axe des Y la valeur d'absorbance correspondant à l'un de nos échantillons-tests. Ensuite, en traçant une ligne parallèle à l'axe des X, nous la prolongeons jusqu'à ce qu'elle croise notre courbe standard.Ensuite, à partir de la coordonnée X relevée en ce point, nous obtenons la quantité, en micro-moles, de tyrosine libérée lors de cette réaction protéolytique particulière. Pour déterminer l'activité de l'enzyme en unités par millilitre, effectuez le calcul suivant : prenez le nombre de micro-moles d'équivalents de tyrosine libérés, obtenu à partir de la courbe standard, et multipliez-le par le volume total du dosage en millilitres, qui dans notre cas est de 11 millilitres. Divisez ensuite cette valeur par trois autres grandeurs.La durée du dosage, que nous avons effectuée pendant 10 minutes, le volume d'enzyme utilisé dans le dosage, qui a été variable. Utilisons un millilitre. Le volume en millilitres utilisé dans la détection chlorométrique, qui peut varier selon votre Q vet.Nous utilisons deux millilitres. Le nombre de micromoles de tyrosine divisé par le temps en minutes nous donne notre mesure de l'activité protéasique que nous appelons unités. Nous pouvons annuler les unités de mesure de volume au numérateur et au dénominateur et obtenons ainsi une mesure de l'activité enzymatique exprimée en unités par millilitre.Afin de déterminer l'activité d'un échantillon solide de protéase dilué dans un diluant d'enzyme, nous divisons notre activité exprimée en unités par millilitre par la concentration du solide utilisé initialement dans ce dosage, exprimée en milligrammes par millilitre, ce qui nous donne l'activité en unités par milligramme. Nous venons de vous montrer comment analyser l'activité protéasique à l'aide du dosage universel de l'activité protéasique de Sigma. Comme vous l'avez constaté en réalisant cette procédure, il est essentiel de se souvenir de chauffer lentement les solutions de caséine et de tyrosine, sans les porter à ébullition.En outre, il est essentiel de préparer des blancs différents pour vos étalons ainsi que pour chaque échantillon testé. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences sur l'activité protéasique.

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Cette méthode décrit un essai de sédimentation in vitro à base de lectine pour quantifier l’affinité de liaison de la phosphatase glucane et de l’amylopectine. Ce test de co-sédimentation est fiable pour mesurer la liaison du substrat de la phosphatase glucane et peut être appliqué à divers substrats de glucane solubilisés.

Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes

Apprenez à mesurer l'activité des protéases par dosage colorimétrique de la tyrosine libérée après digestion de la caséine. Cette méthode standardisée assure le contrôle qualité des préparations enzymatiques en laboratoire.

Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat

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