Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat

Les protéases rompent les liaisons peptidiques en laboratoire. Il est souvent nécessaire de mesurer ou de comparer l'activité des protéases Sigma. Le dosage universel de l'activité protéolytique peut être utilisé comme procédure normalisée pour déterminer l'activité des protéases, ce que nous faisons lors de nos procédures de contrôle qualité.

Dans ce dosage, la casianine agit comme substrat lorsque la protéase que nous testons digère la casianine. L'acide aminé tyrosine est libéré avec d'autres acides aminés et fragments peptidiques. La tyrosine libre réagit ensuite avec le phénol de la réactif de Folin-Ciocalteu ou réactif de Folin pour produire un chromophore bleu, qui est quantifiable et mesuré sous forme de valeur d'absorbance sur le spectrophotomètre.

Plus la tyrosine libérée à partir de la caséine est importante, plus les chromophores sont générés et plus l'activité de la protéase est élevée. Les valeurs d'absorbance produites par l'activité de la protéase sont comparées à une courbe standard établie en faisant réagir des quantités connues de tyrosine avec le réactif de Folin-Ciocalteu (FC), afin de corréler les variations d'absorbance. À partir de la quantité de tyrosine, exprimée en micromoles, obtenue grâce à la courbe standard, l'activité des échantillons de protéase peut être déterminée en unités, correspondant à la quantité de micromoles d'équivalent tyrosine libérée à partir de la caséine par minute. Bonjour, je m'appelle Carrie Cup Vineyard et je suis scientifique au sein de notre installation Sigma Aldridge DeKalb ici à St. Louis, Missouri.

Aujourd'hui, je vais vous montrer une méthode universellement applicable pour tester l'activité protéasique chez Sigma Aldridge. Nous utilisons principalement ce dosage dans notre service de contrôle qualité afin de garantir que notre protéase possède une activité suffisante avant de vous l'expédier directement à votre laboratoire. Avant de commencer le dosage, nous devons nous assurer que les réactifs suivants sont correctement préparés.

Un tampon phosphate de potassium à 50 millimolaire, pH 7,5. La solution est placée à 37 degrés Celsius avant utilisation, une solution de kasian à 0,65 % poids/volume préparée en mélangeant 6,5 milligrammes par millilitre dans un litre. La température de la solution est progressivement augmentée avec une agitation douce à 80 à 85 degrés Celsius pendant environ 10 minutes jusqu'à l'obtention d'une dispersion homogène.

Il est très important de ne pas faire bouillir la solution. Le pH est ensuite ajusté si nécessaire à l'aide d'hydroxyde de sodium et d'acide chlorhydrique. Une solution d'acide trichloroacétique à 110 millimolaire, préparée en diluant un stock à 6,1 normal dans un rapport de 1 à 55 avec de l'eau purifiée à 0,5 millimolaire, contient des sels de fer ou du réactif au phénol, qui est la solution qui réagira avec la tyrosine pour produire un changement de couleur mesurable.

Cela sera directement lié à l'activité des protéases. Une solution de carbonate de sodium à 500 millimolaire préparée à l'aide de 53 milligrammes par millilitre de carbonate de sodium anhydre dans de l'eau purifiée, et une solution diluante d'enzyme, constituée d'un tampon d'acétate de sodium à 10 millimolaire avec 5 millimolaire de calcium à pH 7,5 à 37 degrés Celsius. Cette solution est celle que nous utilisons pour dissoudre les échantillons de protéase solides ou diluer les solutions enzymatiques.

La solution mère normalisée de L-tyrosine, qui doit avoir une concentration initiale de 1,1 millimolaire, soit une solution de 0,2 milligramme par millilitre de L-tyrosine, est préparée dans de l'eau purifiée et chauffée doucement jusqu'à dissolution complète de la tyrosine. Comme pour la caséine, ne pas faire bouillir cette solution. Laisser la solution normalisée de L-tyrosine refroidir à température ambiante.

Cette solution sera davantage diluée pour établir notre courbe standard si nécessaire, à l’aide d’un échantillon solide de protéase dont l’activité est prédéterminée et qui est dissous dans un diluant d’enzyme à raison de 0,1 à 0,2 unité par millilitre. Cette solution sert de témoin positif pour le test de contrôle qualité, et de validation pour les calculs que nous effectuerons afin de déterminer l’activité enzymatique. Maintenant que nous avons préparé nos réactifs et qu’ils sont tous à la température appropriée, nous allons commencer notre dosage de la protéase.

Pour commencer ce dosage, choisissez des vials appropriés pouvant contenir environ 15 millilitres. Pour chaque enzyme que vous allez tester, vous aurez besoin de quatre vials. Un vial sera utilisé comme blanc, et les trois autres serviront à doser l'activité de trois.

La dilution de la protéase en trois dilutions est utile lors de la vérification croisée de nos calculs finaux. Ajouter à chaque ensemble de quatre flacons cinq millilitres de notre solution de kasaïne à 0,65 % et les laisser équilibrer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes. Ensuite, ajouter des concentrations variables de notre solution d'enzyme à trois des flacons d'échantillon test, mais pas au témoin. Les mélanger par agitation circulaire et incuber à 37 degrés Celsius pendant exactement 10 minutes.

L'activité protéasique et la libération consécutive de tyrosine au cours de cette période d'incubation seront mesurées et comparées entre nos échantillons test. Après cette incubation de 10 minutes, ajoutez cinq millilitres du réactif TCA dans chaque tube. Ensuite, un volume approprié de solution enzymatique est ajouté à chaque tube, y compris au témoin, de sorte que le volume final de solution enzymatique dans chaque tube soit d'un millilitre.

Cela permet de tenir compte de la valeur d'absorbance de l'enzyme elle-même. Incubez maintenant les solutions à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant cette incubation de 30 minutes, vous pouvez préparer les dilutions de la courbe étalon de tyrosine, qui s'effectue à l'aide de six vials DR.

Cela peut facilement contenir huit millilitres répartis entre les six vials. La solution mère de tyrosine à 1,1 millimolaire est ajoutée aux volumes suivants, en millilitres : 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 et 0,5. N'ajoutez aucune solution mère de tyrosine au témoin.

Des normes inférieures peuvent être nécessaires pour les échantillons de test IPU qui présenteront une faible variation de couleur. Une fois la solution standard de tyrosine ajoutée, ajouter un volume approprié d'eau purifiée à chacun des standards afin d'ajuster le volume à deux millilitres. Après l'incubation, filtrer chacune des solutions d'essai ainsi que le témoin.

À l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micron, deux millilitres des échantillons d’essai et du filtrat témoin sont ensuite ajoutés à quatre fioles DR pouvant contenir au moins huit millilitres. Vous pouvez utiliser le même type de fiole que celui utilisé pour préparer les étalons. Dans toutes les fioles contenant les étalons et l’étalon témoin, ajoutez cinq millilitres de carbonate de sodium, puis, pour de meilleurs résultats, ajoutez immédiatement après le réactif tombé. Ajoutez ensuite du carbonate de sodium à vos échantillons d’essai et au témoin d’essai. Vous remarquerez que ces solutions deviennent troubles après l’ajout du carbonate de sodium.

Ensuite, le réactif précipité est ajouté, qui réagira avec la tyrosine libre. Les vials DRAM sont alors mélangés par agitation en vortex et incubés à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes après cette incubation. Vous devriez observer que les témoins présentent une gradation de couleur corrélant avec la quantité de tyrosine ajoutée, les concentrations les plus élevées de tyrosine apparaissant en teinte la plus foncée.

Vous pouvez également observer un changement de couleur appréciable dans nos échantillons de test. Deux millilitres de ces solutions sont filtrés à l'aide d'un filtre à seringue de 0,45 micron et d'une cuvette appropriée. Maintenant que notre dosage est terminé, passons au spectrophotomètre et enregistrons nos valeurs d'absorbance.

L'absorbance de nos échantillons est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre utilisant une longueur d'onde de 660 nanomètres. Le trajet optique est réglé à un centimètre ; enregistrez les valeurs d'absorbance pour les étalons, le témoin zéro, les différents échantillons d'essai et le témoin d'essai. Une fois toutes les données recueillies, nous sommes prêts à établir notre courbe d'étalonnage.

Afin de générer la courbe, il faut calculer la différence d'absorbance entre l'étalon et le blanc de l'étalon. Cette valeur d'absorbance correspond à celle attribuable à la quantité de tyrosine présente dans les solutions étalons. Après ce calcul simple, nous établissons notre courbe standard en portant sur l'axe des Y la variation d'absorbance de nos étalons, et sur l'axe des X la quantité, en micromoles, pour chacun de nos cinq étalons.

Une fois que nous avons saisi nos points de données et généré une droite de régression, nous déterminons la variation d'absorbance dans nos échantillons-tests en calculant la différence entre l'absorbance de l'échantillon-test et celle du témoin-test. En consultant notre courbe standard, nous repérons sur l'axe des Y la valeur d'absorbance correspondant à l'un de nos échantillons-tests. Ensuite, en traçant une ligne parallèle à l'axe des X, nous la prolongeons jusqu'à ce qu'elle croise notre courbe standard.

Ensuite, à partir de la coordonnée X relevée en ce point, nous obtenons la quantité, en micro-moles, de tyrosine libérée lors de cette réaction protéolytique particulière. Pour déterminer l'activité de l'enzyme en unités par millilitre, effectuez le calcul suivant : prenez le nombre de micro-moles d'équivalents de tyrosine libérés, obtenu à partir de la courbe standard, et multipliez-le par le volume total du dosage en millilitres, qui dans notre cas est de 11 millilitres. Divisez ensuite cette valeur par trois autres grandeurs.

La durée du dosage, que nous avons effectuée pendant 10 minutes, le volume d'enzyme utilisé dans le dosage, qui a été variable. Utilisons un millilitre. Le volume en millilitres utilisé dans la détection chlorométrique, qui peut varier selon votre Q vet.

Nous utilisons deux millilitres. Le nombre de micromoles de tyrosine divisé par le temps en minutes nous donne notre mesure de l'activité protéasique que nous appelons unités. Nous pouvons annuler les unités de mesure de volume au numérateur et au dénominateur et obtenons ainsi une mesure de l'activité enzymatique exprimée en unités par millilitre.

Afin de déterminer l'activité d'un échantillon solide de protéase dilué dans un diluant d'enzyme, nous divisons notre activité exprimée en unités par millilitre par la concentration du solide utilisé initialement dans ce dosage, exprimée en milligrammes par millilitre, ce qui nous donne l'activité en unités par milligramme. Nous venons de vous montrer comment analyser l'activité protéasique à l'aide du dosage universel de l'activité protéasique de Sigma. Comme vous l'avez constaté en réalisant cette procédure, il est essentiel de se souvenir de chauffer lentement les solutions de caséine et de tyrosine, sans les porter à ébullition.

En outre, il est essentiel de préparer des blancs différents pour vos étalons ainsi que pour chaque échantillon testé. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences sur l'activité protéasique.