In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d'œufs de Xénope

Les extraits d'œufs de Xip Labus sont utiles comme matériel cytoplasmique et organellaire pour la reconstitution in vitro d'événements cellulaires tels que l'assemblage nucléaire et l'importation de protéines nucléaires. Lorsque de l'ADN de chromatine spermatique est ajouté à des extraits d'œufs XUS bruts ou fractionnés, les vésicules membranaires présentes dans l'extrait se lient à la surface de la chromatine, fusionnent et incorporent des composants des pores nucléaires pour former des noyaux synthétiques entièrement fonctionnels. La caractérisation de la base moléculaire de ces processus devient alors possible par immunoprécipitation des extraits et par édition protéique.

Bonjour, je m'appelle Marie Cross et je suis étudiante diplômante dans le laboratoire de la Dre Maureen Power, au Département de biologie cellulaire de l'Université Emory à Atlanta, en Géorgie. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment former des noyaux in vitro à l'aide d'extraits d'œufs de xénope fractionnés. Cette procédure comprend les étapes suivantes : réaliser la réaction d'assemblage nucléaire et évaluer la formation des noyaux.

Commençons. Pour initier l'assemblage nucléaire, prélevez un aliquot de cytosol fractionné et ajoutez du phosphocréatine provenant d'une solution mère de 0,2 molaire afin d'obtenir une concentration finale de 20 millimolaires. Ensuite, ajoutez la créatine kinase provenant d'une solution mère de 5 milligrammes par millilitre afin d'obtenir une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre.

Enfin, ajoutez de l'ATP à 20 micromolaire en utilisant un stock à 0,2 molaire. Ensuite, ajoutez les membranes légères au cytosol selon un dilution de un à dix. Ceci correspond approximativement à la quantité de membrane présente dans l'extrait brut initial.

Mélanger tous les composants par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette afin de disperser les membranes dans l’extrait. Cette étape doit être réalisée avant d’ajouter la chromatine de spermatozoïdes. Ensuite, ajouter la chromatine de spermatozoïdes à l’extrait fractionné à la concentration souhaitée et mélanger immédiatement l’extrait et la chromatine de spermatozoïdes par aspiration et expulsion douces à l’aide d’une pipette munie d’une pointe coupée.

Lorsque la chromatine des spermatozoïdes est ajoutée à l'extrait, elle commence immédiatement à se décondenser, à se condenser et devient sensible à la fragmentation. Généralement, ces réactions sont réalisées dans des tubes de centrifugation de 500 microlitres avec un volume total inférieur à cent microlitres. Les extraits d'œufs permettent la formation de 8 000 à 9 000 structures.

Incuber le mélange à raison de noyaux par microlitre pendant une à deux heures à température ambiante pour permettre la formation des noyaux. Les noyaux sont visualisés à l'aide d'une coloration. Après environ 30 minutes, les noyaux nouvellement formés seront petits et de forme ovale.

L'ADN est encore assez condensé et le noyau doit apparaître comme une masse bleu clair uniforme provenant de l'enroulement de l'hameçon lorsqu'il est observé en canal UV, car l'ADN se condense. En outre, la coloration bleue sera moins homogène, des espaces noirs apparaissant progressivement. La formation de l'enveloppe nucléaire peut être visualisée en ajoutant un microgramme par mâle de trois trois diaa carboxylamine ou DHCC dans le fixateur.

DHCC est un colorant lipophile fluorescent qui est visualisé dans le canal de la fluorescéine. Aux premiers stades de l'assemblage des noyaux, des vésicules membranaires s'associent à la surface de la chromatine et commencent à fusionner par plaques. Cela donne une apparence inégale et discontinue de la membrane en formation.

Une fois la membrane formée, elle s'ajuste uniformément sur la surface nucléaire et apparaît comme un liseré régulier et continu entourant l'ADN. Une fluorescence de fond importante sera présente dans le cytosol environnant en raison de vésicules membranaires qui ne se sont pas intégrées aux noyaux. Nous venons de vous montrer la reconstitution in vitro de noyaux à l'aide de fractions solubles et de fractions légères membranaires provenant d'extrait d'œuf de Xenopus.

Il est important de se rappeler que l'extrait brut peut être utilisé pour l'assemblage nucléaire, mais pas après une congélation et une décongélation. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.