L'aide de pincettes laser pour la manipulation neurones isolés in vitro

Ashkin a été le premier à montrer que les pinces laser ou les pièges optiques constituent un outil puissant pour manipuler des objets vivants microscopiques micronisés. Dans cette vidéo, nous montrerons comment nous avons appliqué cette technologie pour capturer et déplacer des neurones. Voici la station de travail équipée de pinces optiques.

Les flèches vertes montrent le trajet suivi par le faisceau laser à travers l'optique du microscope. Lorsqu'un faisceau laser focalisé par l'objectif du microscope est réfracté par une cellule, la force qui modifie la direction du rayon lumineux agit sur la cellule et la déplace vers le centre de focalisation.

Cela génère des piconewtons de force suffisants pour déplacer une cellule à travers un milieu. Dans cette vidéo, nous aborderons la fabrication des boîtes, la préparation des cellules rétiniennes, la mise en culture des cellules sur des boîtes, la manipulation par pinces laser et l’observation de la croissance cellulaire. Étant donné que les cellules adhèrent au verre, nous avons dû créer une zone répulsive pour les cellules où celles-ci peuvent être facilement piégées à l’aide des pinces.

La moitié de la boîte a été recouverte de poly-héma, un polymère répulsif pour les cellules. L'autre moitié a été recouverte de cellule un, un substrat qui favorise la croissance de nos cellules. Tout d'abord, une cellule est identifiée du côté adhésif pour les cellules de la boîte.

Une autre cellule est ensuite piégée du côté du polymère et transportée vers le côté adhésif, où les deux cellules sont appariées. Pour préparer les boîtes, nous utilisons des boîtes de culture stérilisées en polystyrène soufflé, de 35 millimètres de diamètre. Tout d'abord, nous découpons un trou d'un centimètre de diamètre dans le fond à l’aide d’un petit tour ou d’une perceuse à colonne.

Prenez des lamelles propres à l'acide et placez-les verticalement dans un environnement sans poussière, comme une hotte. Prenez la solution de polyus dissoute dans de l'alcool à 95 % et déposez quelques gouttes près du haut de la lamelle, uniquement sur une moitié. Laissez sécher le poly-hema. Marquez le côté de la lamelle contenant le polyus.

Placer le S guard autour du trou situé au fond de la boîte de culture. Coller le couvre-objet à la boîte avec le S guard. Veiller à ce que le polyamide soit à l'intérieur et s'assurer qu'il n'y ait aucune fuite par les interstices du seuil de protection.

Placer la lame de verre de manière à ce que le bord du revêtement de poly-héma s'étende au centre de la boîte. Laisser sécher la boîte pendant deux à trois jours, puis rayer le fond de la boîte à l'aide d'un stylo à pointe en diamant en faisant des marques qui serviront de points de repère pour positionner la boîte sur la platine du microscope. Placer les boîtes dans la hotte et les stériliser sous lumière ultraviolette.

Déposez une ou deux gouttes de solution d'anticorps caprin anti-US sur le côté non polyus du plat, en prenant soin de ne pas en renverser sur le revêtement polyhémique, et laissez agir environ trois heures. Éliminez-la et rincez avec de la solution de Ringer stérile. Appliquez la solution d'anticorps primaire sur la même zone et incubez toute la nuit, en prévision de l'expérience le lendemain.

Les cellules utilisées dans notre laboratoire proviennent de rétines de salamandres adultes en phase aquatique. Les rétines sont disséquées et retirées, puis digérées avec une enzyme. La culture peut ensuite être ensemencée avec les cellules isolées.

Les yeux sont retirés. La cornée est disséquée et retirée. La cupule oculaire est placée dans une solution stérile de Ringer.

La rétine est séparée de la cupule oculaire en la retirant avec le bord d'une pince courbe. Du dioxyde de carbone et de l'oxygène sont barbotés dans une solution de Ringer contenant du propane, puis stérilisés à travers un filtre ultra-fin de 0,2 micron. Les rétines sont placées dans la solution enzymatique et digérées pendant environ 40 minutes avec agitation afin de dissocier le tissu.

Après trois lavages, les rétines sont dissociées par tri. À l’aide d’une pipette à bille de trois millimètres, les cellules isolées sont prêtes pour la mise en culture avant la mise en culture. La boîte de culture contenant le milieu est placée sur la platine du microscope et orientée correctement à l’aide des marques de grattage situées au fond de la boîte.

Cela permet de reproduire ultérieurement la position exacte de la boîte. Les cellules sont ensuite ensemencées sur les deux côtés de la boîte, à la fois en poly-héma et en cellules. La position de la boîte sur la platine du microscope, ainsi que la puissance du laser, sont contrôlées à l’aide du joystick.

Tout d'abord, nous avons identifié une cellule adhérente à une paroi latérale de la boîte. Il s'agit d'une cellule multipolaire rétinienne identifiable par ses dendrites. Les coordonnées de la position de la cellule sont enregistrées.

Il s'agit d'une cellule photoréceptrice en bâtonnet située du côté du plat recouvert d'une substance répulsive pour les cellules polyaires. Le plat est abaissé et la cellule est capturée par le laser puis soulevée au-dessus du fond du plat. La cellule est désormais transportée vers l'autre extrémité du plat, aux coordonnées de la cellule multipolaire.

En réalité, la cellule est immobile. C'est la boîte qui se déplace. La cellule passe maintenant par-dessus le bord du revêtement poly hemo.

La saillie qui s'étend à partir de la cellule est le terminaison axonale. La cellule est bien dégagée des débris et des autres cellules présentes au fond de la boîte, qui pourraient entraver son déplacement. Les images floues des cellules situées au fond de la boîte sont visibles en arrière-plan.

La cellule en bâtonnet parvient à la cellule multipolaire et peut être positionnée avec précision au point souhaité et à la distance voulue par rapport à cette cellule. La boîte est soulevée et la cellule adhère au substrat d'une cellule. Les principaux avantages de cette procédure sont la possibilité de choisir les cellules à déplacer et le fait que les manipulations peuvent s'effectuer dans le cadre d'une expérience stérile fermée.

Les interactions entre cellules peuvent être surveillées par microscopie vidéo en lapse de temps ou par photographie numérique. Les pinces laser peuvent être utilisées avec n'importe quelle technique biologique. Ici, par exemple, une technique de fluorescence met en évidence la présence de protéines synaptiques aux points de contact entre les cellules déplacées par les pinces.