Name: Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Découvrez un test de gène rapporteur basé sur la luciférase pour étudier la biogenèse membranaire après phagocytose. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique impliquée dans la synthèse des lipides.

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Culture de cellules <ol><li> Cultures stock de rein embryonnaire humain 293 (HEK293) les cellules sont cultivées dans 10 cm de boîtes de culture en «milieu A &#39;, composé de milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM) supplémenté avec un cocktail d&#39;antibiotiques (100 unités par ml de pénicilline et 100 pg par ml de sulfate de streptomycine) et 10% de sérum fœtal bovin (FBS). </li><li> Pour mettre en place des cellules d&#39;une expérience, le milieu est aspiré et les cellules sont lavées deux fois avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Le PBS est ensuite retiré et remplacé par 0,6 ml d&#39;une solution contenant 0,25% de trypsine. </li><li> Le plat est incubé à 37 ˚ C pendant environ 2 min jusqu&#39;à ce que les cellules ont commencé à se détacher. </li><li> 5,5 ml de milieu A est ajouté pour neutraliser la trypsine et les cellules sont comptées avec un hémocytomètre. </li><li> Les cellules sont diluées à 320.000 cellules par ml et distribués à 0,1 ml par puits dans une polylysine enduits plaque de 96 puits de culture. </li><li> Placer le plat dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ˚ C avec une atmosphère contenant du CO2 de 8,8% et de grandir pendant 24 heures. </li></ol> Transfections <ol><li> En se préparant pour les transfections, il devrait être considéré comme le nombre de répétitions sont à effectuer par les conditions expérimentales et quelles quantités de plasmide sera transfectées. Nous faisons régulièrement effectuer toutes les conditions en triple exemplaire et transfecter un total de 50 à 100 ng d&#39;ADN plasmidique par puits. Mélange plasmidique devrait comprendre au moins un journaliste construction exprimant la luciférase de luciole et un contrôle luciférase Renilla plasmidique exprimant à partir d&#39;un promoteur constitutif. </li><li> Solutions de plasmide sont pipetés dans des microtubes de 1,5 ml et complété avec 10 pi par échantillon de sérum et sans antibiotique DMEM. Par exemple, si 20 puits sont chacun à être transfectées avec 50 ug d&#39;ADN, ajouter 200 pl de DMEM à 1 ug d&#39;ADN. </li><li> Pour la solution de DMEM / ADN ajouter 3 ul &#39;Transit 293 réactifs »(Mirus) par ug d&#39;ADN. Mélanger à la pipette up &amp; down et laissez les échantillons reposer à température ambiante pendant au moins 10 min. </li><li> Durant cette période, retirez le support de la plaque de 96 puits de culture et de le remplacer par 90 ul de milieu frais A. </li><li> Pour chaque bien ajouter 10 ul de la DMEM / DNA / Transit 293 mélange. </li><li> Placer le plat dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ˚ C avec une atmosphère contenant du CO2 de 8,8% et de grandir pendant 24 heures. </li></ol> Phagocytose <ol><li> Préparer les suspensions contenant le milieu B (un mélange 1:1 de DMEM et Ham F12, plus des antibiotiques et 10% de FBS) majoré de 0,75 um de billes de latex à zéro à 1 mg par ml. </li><li> Retirez le support de la plaque de 96 puits de culture et de la remplacer par 0,1 ml de suspensions de billes dans le milieu B. </li><li> Faites tourner la plaque pendant 2 min à 1000 x g. </li><li> Les cellules sont ensuite cultivées à 37 ˚ C pendant 6 à 16 heures. Selon les conditions et le promoteur utilisé pour piloter la luciférase, une expression accrue du gène rapporteur peut être détectée après 1 à 3 heures. </li><li> Dans ce cas même il peut être nécessaire d&#39;incuber les cellules avec des billes de 30 à 60 min, puis faire deux lavages avec du PBS pour éliminer des billes non constituée en société, et d&#39;ajouter des milieux frais avant d&#39;incuber les cellules pour des périodes supplémentaires de temps. </li></ol> Double-GloTM Luciferase Assay <ol><li> Remarque: notre protocole pour l&#39;utilisation de ce kit diffère à certains égards de celle recommandée par le fabricant. Il a été modifié pour réduire la quantité de réactifs nécessaires par échantillon. </li><li> Préparer une solution de 1 M de DTT, la diviser en plusieurs petites portions et les conserver à -20 ˚ C. </li><li> Préparer un tampon de lyse contenant 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) de glycérol, et de 0,5% (v / v) de Triton X-100. Avant utilisation, une partie aliquote montant nécessaire pour l&#39;expérience et ajouter 1 l par ml de 1 M de DTT, plus un cocktail inhibiteur de la protéase à une concentration finale de 0,5 à 1x. Ne pas réutiliser les restes de la solution la TNT. </li><li> Lorsque vous utilisez le kit Dual-GloTM pour la première fois, de préparer le réactif (Firefly) luciférase en transférant l&#39;intégralité du contenu d&#39;une bouteille de tampon luciférase Dual-GloTM (fourni avec le kit) pour une bouteille de substrat luciférase Dual-GloTM (à condition avec le kit). Répartissez les réactifs non utilisés luciférase dans des aliquotes de 10 ml et conserver à -20 ˚ C. </li><li> Retirer la plaque de 96 puits de la incubateur de culture tissulaire et le placer sur la glace. Retirez le support par aspiration, ajouter 40 ul par puits de tampon de lyse, puis laisser la plaque sur la glace pendant 30 min. </li><li> Dans un blanc, opaque plaque de 96 puits (OptiplateTM-96, Perkin Elmer numéro de catalogue 6005290) aliquot 15 ul par puits de réactif luciférase, puis ajouter 15 ul de lysat cellulaire. </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 min puis lisez la luminescence dans un lecteur de microplaques. </li><li> Immédiatement avant utilisation, préparer une quantité appropriée de solution de substrat Renilla luciférase en ajoutant 1 partie double GloTM Stop &amp; Glo ®; Réactif (fourni avec le kit) pour 100 parties Dual-Stop &amp; Glo GloTM ® Tampon (fourni avec le kit). </li><li> Pour chaque puits ajouter 15 ul par puits de la solution de substrat luciférase Renilla, incuber à température ambiante pendant 10 min, puis de mesurer la luminescence de nouveau. </li></ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

etudier biogenèse des membranes avec un luciferase assay-based gène rapporteur

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Pour étudier la coordination des différentes voies de synthèse des lipides au cours biogenèse membranaire, il est utile de travailler avec un système expérimental, où la biogenèse membranaire survient rapidement et de façon inductible. Nous avons trouvé que la phagocytose de billes de latex est pratique à ces fins que les cellules rapidement synthétiser les lipides des membranes pour reconstituer les piscines membrane perdue matériau d&#39;emballage au cours engloutissement de particules. Ici, nous décrivons les procédures pour l&#39;étude des changements dans la phagocytose induite par l&#39;expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur en utilisant le système Dual-Glo Luciferase Assay de Promega.

Ici, nous décrivons les procédures pour l&#39;étude des changements dans la phagocytose induite par l&#39;expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur utilisant le système à double GloTM Luciferase Assay de Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

Pour étudier la coordination des différentes voies de synthèse des lipides lors de la biogenèse membranaire, il est utile de travailler avec un système expérimental où la membrane...

Bonjour, je suis IL OV, et j'étudie la coordination des différentes voies de synthèse des lipides en lien avec la mémoire et la biogenèse. Il est utile de disposer d'un système expérimental dans lequel la biogenèse membranaire se produit rapidement et de manière inductible. Nous avons constaté que la phagocytose de billes de latex est particulièrement intéressante pour ces études, car les cellules synthétisent très rapidement de nouvelles membranes afin de remplacer celles qui ont été perdues comme matériau d'enrobage au début du processus d'englobement.Dans cette vidéo, mon collègue Ong Zang démontrera les procédures utilisées pour étudier les modifications de l'expression génique induites par la phagocytose, en employant une approche de test rapporteur basée sur la luciférase. Bonjour, je suis X du laboratoire d'exon North du Département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université Harvard. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment utiliser un test de gène rapporteur pour analyser la régulation des gènes impliqués dans la biogenèse membranaire après la phagocytose. Commençons donc.Pour cette procédure, nous utilisons des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines 293. Ces cellules sont cultivées dans une boîte de culture de 10 centimètres de diamètre dans un milieu A, constitué du milieu de Dulbecco modifié d’Eagle ou DMEM, complété avec 10 % de sérum de veau fœtal ou FBS et un cocktail d’antibiotiques. À l’aide d’une technique de standardisation, les cellules sont détachées du fond de la boîte, comptées, puis ensemencées dans des plaques de 96 puits revêtues de polylysine, où elles sont cultivées pendant 24 heures avant le début des transfections.Pour notre transfection, nous réalisons systématiquement toutes les conditions en triplicat, avec une quantité totale de 50 à 100 nanogrammes d'ADN plasmidique par puits. Les mélanges doivent inclure au moins le construit rapporteur exprimant la luciférase de luciole et le plasmide témoin exprimant la luciférase de rein sous un promoteur constitutif. Pour commencer, préparez un mélange de DMEM sans sérum ni antibiotique avec le réactif de transfection Transfectant 2 N 3 : utilisez 10 microlitres de DMEM pour chaque puits à transfecter, et 3 microlitres du réactif Transfectant 293 par microgramme d'ADN plasmidique.Par exemple, si 20 puits doivent être transfectés avec 50 nanogrammes d'ADN en présence de trois microlitres de réactif trans 2 9 3 dans 200 microlitres de DM EM. La solution est homogénéisée par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette, puis laissée au repos à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Ensuite, l'ADN est transféré dans des tubes microcentrifugeurs séparés. Les concentrations de nos solutions mères de plasmide se situent généralement entre 10 et 100 nanogrammes par microlitre.Une fois que le mélange de transit DM M a incubé pendant cinq minutes, il est transféré dans le tube d'ADN et la solution est à nouveau mélangée par pipetage. Laisser ensuite les échantillons au repos à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant l'incubation de 20 minutes, retirer le milieu du plateau de culture à 96 puits et le remplacer par 19 microlitres de milieu frais A une fois l'incubation terminée, puis ajouter 10 microlitres du mélange D-M-M-D-N-A traduit en trois à chaque puits.Le mélange doit être pipeté directement dans le liquide existant. N'allowez pas à l'embout de la pipette de toucher la paroi du tube. Il est également important d'inclure trois puits de cellules qui resteront non traités et inspectés.L'activité moyenne de la luciférase dans ces puits sera ultérieurement soustraite en tant que fond. Placer la plaque de 96 puits dans l'incubateur à 37 degrés C et faire croître les cellules pendant 24 heures. Une fois l'incubation de 24 heures terminée, nous procédons à l'induction de la biosynthèse membranaire, la biosynthèse des billes lax. Pour commencer, préparer une suspension contenant du milieu de culture cellulaire et une bille lax.Pour ce faire, préparez le milieu B, qui est un mélange équivalent de DM EM et de milieu hemps, complété par des antibiotiques et 10 % de SBF. Ajoutez ensuite les billes de 0,75 micron à des concentrations allant jusqu'à un milligramme par millilitre. Bien entendu, chaque expérience doit inclure des témoins auxquels aucune bille n'est ajoutée.Ensuite, retirez le milieu de la plaque de culture à 96 puits et remplacez chaque puits par 100 microlitres de la suspension de billes. Une fois la suspension ajoutée, centrifugez la plaque pendant deux minutes à 1000 ×g. Cela permet de concentrer les billes au fond du puits et facilite la phagocytose. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés C pendant six à 16 heures.En fonction des conditions et du promoteur utilisé pour induire l'augmentation de la luciférase, l'expression du gène promoteur peut être détectée entre une et trois heures. Pour certaines expériences, il peut être nécessaire de dissocier fal de la synthèse des lipides, par exemple pour étudier les effets de certains médicaments sur la synthèse lipidique sans affecter la formation des particules. Dans de tels cas, incuber les cellules avec les billes pendant 30 à 16 minutes afin de permettre aux cellules d'internaliser les billes.Après cette incubation, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS afin d'éliminer les billes non incorporées. Ensuite, du milieu frais est ajouté, puis les cellules sont incubées de six à seize heures pour l'expression du gène rapporteur. Nous sommes maintenant prêts à passer aux essais ferreux.Pour commencer les dosages de luciférase, préparez un tampon xis contenant 20 millions de molarités d'arbres, HCl pH 7,8, 10 % volume/volume de glycérol et 0,5 % volume/volume de Triton X-100. Préparez juste avant utilisation la quantité nécessaire à l'expérience. Ajoutez ensuite un microlitre par millilitre d'une solution de DTT à une molaire. Ne réutilisez pas la solution de DTT restante.Ensuite, ajoutez un cocktail d'inhibiteurs de protéase à une concentration finale de 0,5 à une fois, lors de la première utilisation du kit dual glow, préparez le réactif de luciférase de feu en transférant la totalité du contenu d'un flacon de tampon dual glow luciférase dans un flacon de substrat de luciférase dual glow. Répartissez le réactif de luciférase inutilisé en aliquots de 10 millilitres et conservez-les à moins 20 degrés C. Une fois le réactif de luciférase prêt, retirez la plaque 96 puits de l'incubateur de culture tissulaire et placez-la sur de la glace. Ensuite, retirez le milieu par aspiration, puis ajoutez 40 microlitres par puits de tampon de lyse et laissez la plaque sur glace pendant 30 minutes.Ensuite, ajouter 15 microlitres de réactif Lucifer par puits. Dans une plaque opaque blanche à 96 puits, nous utilisons la plaque Perkin S optive 96. Puis ajouter 15 microlitres d'extrait cellulaire et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes.Après 10 minutes, lire la luminescence à l'aide d'un lecteur de microplaques. Ensuite, réaliser le dosage de la luciférase vanille afin d'obtenir des données pour le plasmide témoin. Pour ce faire, préparer immédiatement avant, une quantité appropriée de solution de substrat de luciférase en ajoutant une partie de réactif dual glow, stop and glow à 100 parties.Luminescence double, arrêter et tampon luminescent. Ensuite, ajouter 15 microlitres de solution de substrat à chaque puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes, puis mesurer à nouveau la luminescence.Veuillez noter que nous avons modifié le protocole recommandé par le fabricant pour ces dosages bioluminescents ferreux. Afin de réduire la quantité de réactifs nécessaire par échantillon, la plaque peut désormais être analysée à nouveau à l'aide d'un lecteur de plaques. Une fois les données recueillies avec le lecteur de microplaques, elles peuvent être transférées vers un programme de feuille de calcul tel que Microsoft Excel pour une analyse ultérieure.Tout d'abord, calculez la moyenne à partir des trois puits non résectés et soustrayez cette valeur à chacun des points de données. Ensuite, pour chaque puit transfecté, divisez la valeur de la luciférase de luciole par celle de la luciférase de *Renilla*. Puis, pour chaque jeu d'échantillons en triplicata, calculez la moyenne, l'écart type et le coefficient de variation.Dans notre exemple, nous utilisons les différentes concentrations de billes qui ont été tracées sur l'axe des x en fonction du rapport de l'activité luciférase de feu par rapport à l'activité luciférase vanille. Comme vous pouvez le constater, il existe une augmentation dépendante de la dose de ce rapport. Nous venons de vous montrer comment utiliser un dosage de gène rapporteur basé sur la luciférase afin de mesurer l'expression du promoteur du récepteur LDL en réponse à la phagocytose de billes de latex.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous assurer que les cellules sont seulement à 80 à 90 % de confluence au moment de la transfection. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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