Name: Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Apprenez l'enregistrement patch clamp des canaux ioniques dans les oocytes de Xenopus laevis. Cette technique permet de former des scellés gigaohm et d'étudier la physiologie cellulaire avec précision.

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Recette de solution de rétrécissement est du laboratoire de RW Aldrich. Nous remercions les organismes de financement et fondations suivantes pour le soutien: National Institutes of Health, National Science Foundation, l&#39;American Heart Association, la Muscular Dystrophy Association, le B. Donald E. Baxter et Delia Fondation, le Fonds de dotation et les Klingenstein McKnight for Neuroscience.

Partie 1: Retrait de la membrane vitelline <ol><li> Préparer deux séries de pinces. Nous préférons n ° 5 pinces, où un ensemble a été légèrement taillé avec un fichier. Préparez aussi une pipette de transfert en verre par parage et polissage au feu un 7 &quot;pipette Pasteur. </li><li> Recommandé: Pour prévenir les ovocytes de glisser, couper un cercle de grille (carrés de 1 mm) et de la colle dans le fond d&#39;un plat de Pétri 60mm. Ce plat peut être réutilisé indéfiniment si maintenu propre entre deux utilisations. </li><li> Remplissez la boîte de Pétri avec une solution à mi-chemin hyperosmotiques (voir recette) et placer sous un microscope à dissection. </li><li> Retirer 1-3 ovocytes de Xenopus de leur solution d&#39;incubation avec une pipette Pasteur polie et le placer dans le plat. </li><li> Attendre 15s - 2 min pour les cellules de commencer à se rétrécir. Des temps plus longs rendent les cellules plus faciles à peler; réduction des délais de cellules saines pour patcher. </li><li> Comme les cellules se rétrécit, la membrane vitelline va commencer à devenir à peine visible comme une couche transparente sur la cellule. Sélectionnez une cellule saine (sans verticilles ou défauts) pour peler. </li><li> Avec une paire de pince, pincez doucement la membrane vitelline, sans endommager la membrane plasmique. Avec l&#39;autre, saisir près au même endroit et doucement déchirer la membrane claire et libre en dehors de la cellule. </li><li> Avec la pipette Pasteur, soigneusement déplacer la cellule vers la chambre d&#39;enregistrement. Notez que la cellule va être fragile après le retrait vitelline. </li></ol> Partie 2: génération Gigaseal <ol><li> Remplir une pipette d&#39;enregistrement avec une solution saline. Utilisez le volume minimal de solution qui permet un bon contact électrique avec le fil électrode afin de minimiser la capacité pipette. </li><li> Flick la pipette plusieurs fois pour permettre aux bulles à flotter et glisser sur le fil électrode. Appliquer une pression à la pipette remplie. Cela peut être fait par la bouche ou avec une pompe d&#39;aquarium dans une animalerie. Cette pression est essentiel pour maintenir la pipette nettoie comme il traverse l&#39;interface liquide et se déplace à la cellule. </li><li> Trouvez l&#39;ovocyte dans la chambre et de se concentrer fortement sur le bord de la cellule. </li><li> Avec la pipette de la baignoire, le centre de la pointe (hors foyer) au-dessus de la cellule. Cette fois-ci minimise passé dans le bain avant la génération de phoque. </li><li> Baisse de la pipette vers le bas dans la prochaine mise au point nette à la cellule. Le mettre en proximité (~ 50 microns). Vous devriez voir une petite distorsion de solution poussé hors de la pipette par la pression. </li><li> Utilisation du logiciel de patch-clamp, vérifier la résistance de la pipette (notre but est d&#39;environ 3-4 MQ) et zéro le courant en utilisant la tension de décalage. </li><li> Avec une pression positive sur la pipette, déplacer la pointe lentement vers la cellule tout en surveillant la résistance visuellement ou en utilisant un moniteur audio qui génère un signal dont la fréquence est proportionnelle à la résistance. Comme la pointe commence à toucher la cellule, la résistance va augmenter. </li><li> Soudain, mais doucement basculer du positif au négatif de la pression d&#39;environ la même valeur absolue. Résistance devrait augmenter pour sceller la formation. </li><li> La plupart du temps, la formation de joint se produit en quelques secondes, parfois 30-60 secondes sont nécessaires. </li><li> Une fois que la résistance est à 1GΩ, la pression peut être libérée à neutre. Vous avez maintenant un patch sur les cellules. Pour un patch à l&#39;envers, tirez hors de la cellule rapidement. Pour l&#39;extérieur-out, voir ci-dessous. </li></ol> Partie 5: Hors-out topologie (facultatif) <ol><li> Immédiatement après la réalisation d&#39;un gigaseal, la rupture de la membrane. Cela peut être fait avec aspiration forte, mais nous préférons une impulsion de 1 V pour 1 ms. La résistance devrait tomber à un peu plus de la résistance pipette initiale. </li><li> Déplacer la pipette hors de la cellule lentement et en douceur. Vous devriez voir une section de la traction cellule avec la pipette. Soudain, et au sein de quelques secondes, la cellule se cassera le dos et la résistance doivent immédiatement et simultanément retour à GΩs. </li><li> Vous avez maintenant un patch dans la configuration hors-out. Le ectodomaines de tout les canaux ioniques inclus est exposé à la baignoire. </li></ol> Partie 6: Résultats prévus Généralement, les joints de résistance plus élevées sont préférables et plus vivaient. 10 GQ est un bon guide pour la haute qualité des joints. Dans notre expérience, les chances d&#39;obtenir des joints de cette qualité varie en fonction de nombreux facteurs, notamment la cellule et la pipette de qualité. Taux d&#39;acquisition patch peut être plus de 95% avec des cellules saines, des pipettes propre, et un chercheur expérimenté. Ces correctifs peuvent durer pendant plusieurs minutes et sont adaptés à toute étude électrophysiologique des canaux ioniques exprimés dans des ovocytes de Xenopus, y compris les enregistrements mono-canal.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Il ya de nombreux paramètres d&#39;enregistrement électrophysiologiques pas discuté ici. Configuration Rig, la gestion du bruit du système, l&#39;expression de canaux, et des protocoles d&#39;enregistrement sont tous également critique pour de bons résultats expérimentaux. Dans notre expérience, ce sont les paramètres les plus critiques pour la formation de joints d&#39;étanchéité fiable: ovocytes de grande qualité, en enlevant la membrane vitelline rapidement (aka, «peeling»), utiliser des pipettes nouvellement tiré protégé de la p...

<table><tbody><tr><td>Amplificateur de clampage par électrode à succion &amp;et logiciels</td><td>Instrument</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>ou tout autre dispositif similaire (par exemple, HEKA EPC-9 ou Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>Pinces n° 5 (deux paires)</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de rétrécissement des ovocytes</td><td>Réactif</td><td></td><td></td><td>Ingrédient En mMN-méthyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Acide aspartique 220KCl 2Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de N-méthyl-D-glucamine</td></tr><tr><td>maille tissée</td><td>800 µm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

enregistrement patch clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de xenopus

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Depuis son développement en Sakmann et Neher 1, 2, le patch-clamp s&#39;est imposé comme une technique extrêmement utile pour la mesure électrophysiologique des canaux ioniques uniques ou multiples dans les cellules. Cette technique peut être appliquée aux canaux ioniques, tant dans leur environnement natif et exprimé dans des cellules hétérologues, tels que des ovocytes récoltés à partir de la grenouille africaine griffes, Xenopus laevis. Ici, nous décrivons la technique bien établie de l&#39;enregistrement de patch-clamp à partir d&#39;ovocytes de Xénope. Cette technique est utilisée pour mesurer les propriétés des canaux ioniques exprimés soit au sein des populations (macropatch) ou individuellement (un seul canal d&#39;enregistrement). Nous nous concentrons sur les techniques pour maximiser la qualité de la préparation des ovocytes et la génération de phoque. Avec tous les facteurs optimisée, cette technique donne une probabilité de succès au cours de génération d&#39;étanchéité 90 pour cent. Le processus peut être optimisé différemment par chaque chercheur sur la base des facteurs qu&#39;il ou elle trouve le plus important, et nous présentons la démarche qui ont conduit à la plus grande réussite dans nos mains.

Ceci est conçu comme une introduction à l&#39;enregistrement de patch clamp à partir d&#39;ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l&#39;enlèvement membrane vitelline, la formation d&#39;un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Depuis son développement par Sakmann et Neher 1, 2, le patch clamp s'est imposé comme une technique extrêmement utile pour l'électrophysiologie...

Cette procédure commence par l'élimination de la membrane viline des Opus Cytes afin de former correctement les scellements résistants au mégohm nécessaires aux enregistrements en enregistrement par électrode à succion. Une fois la configuration de l'enregistrement en mode cellule entière obtenue, une aspiration peut être appliquée à la pipette pour accéder électriquement au cytoplasme de la cellule, ce qu'on appelle la configuration en mode cellule entière. L'extrémité de la pipette peut ensuite être éloignée de la membrane plasmique jusqu'à ce qu'elle se détache brusquement, afin d'obtenir un petit fragment de membrane où les domaines ectos de canaux sont exposés à la solution bain ; ceci est connu sous le nom de configuration « outside-out ». Go.Hi, je suis Austin Brown du laboratoire du Dr Miriam Goodman, du Département de physiologie moléculaire et cellulaire de l'Université Stanford.Et je suis Brandon Johnson, également du laboratoire Goodman. Dans une vidéo précédente, nous avons montré comment fabriquer des pipettes pour la technique de patch clamp et des électrodes pointues destinées à l'électrophysiologie. Aujourd'hui, nous présenterons une introduction à l'enregistrement

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Courant ionique des canaux BK est enregistrée en utilisant des techniques de patch-clamp. Canaux BK sont exprimés...

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

Nous décrivons une méthode pour quantifier l’activité des ATPases de type P contre-transportant K+ par expression hétérologue des enzymes dans les ovocytes de xénope et en mesurant l’absorption de Rb+ ou Li+ dans les cellules individuelles par spectrophotométrie d’absorption atomique. La méthode est une alternative sensible et sûre aux expériences de flux de radio-isotopes, facilitant les études cinétiques complexes.

Mesure de transport de cations Na, K et H, K-ATPase dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Les ovocytes par spectrophotométrie d&#39;absorption atomique: une alternative à dosages radio-isotopes

Nous avons mis au point une préparation de la moelle du cerveau-moelle intacte pour enregistrer et contrôler l'activité électrique via correctif enregistrement de serrage des neurones et d'autres cellules Mauthner réticulospinales dans embryons de poissons zèbres. Ainsi, nous sommes en mesure d'enregistrer les courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs, l'activité des canaux voltage-dépendants et des potentiels d'action des neurones clés dans un embryon en développement.

Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

L'approche de l'écart de vaseline découpe ouverte est utilisée pour obtenir des enregistrements à faible bruit des courants ioniques et dérogeant canaux ioniques voltage-dépendants exprimées dans des ovocytes de Xenopus à haute résolution de la cinétique de canaux rapides. Avec des modifications mineures, la tension de serrage fluorimétrie peut être couplé au protocole d'ovocytes découpe ouverte.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocytes Cut-ouvert vaseline Gap voltage-clamp Technique Avec Fluorimétrie

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Cet article décrit une amélioration de la Fluorométrie conventionnelle en tension-clamp (VCF) où les acides aminés non naturels fluorescents (fUAA) sont utilisés à la place des colorants maléimidés, pour sondage des réarrangements structurels dans les canaux ioniques. La procédure comprend l'injection d'ADN ovocytaire de Xenopus, la co-injection d'ARN / fUAA et les mesures simultanées de courant et de fluorescence.

Fluorométrie de tension-serre dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytes utilisant des acides aminés fluorescents non naturels

Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.

Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis

Nous présentons ici un protocole pour exprimer les protéines de jonction lacunaire dans les ovocytes Xenopus et enregistrer le courant jonctionnel entre deux ovocytes apposés à l’aide d’un amplificateur commercial conçu pour les enregistrements à double tension ovocytaire dans un mode de mesure à courant latéral élevé.

Enregistrement du courant de jonction de l’espace des ovocytes Xenopus

Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

Apprenez l'enregistrement patch clamp des canaux ioniques dans les oocytes de Xenopus laevis. Cette technique permet de former des scellés gigaohm et d'étudier la physiologie cellulaire avec précision.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

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