Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable

Les pipettes capillaires en verre sont devenues omniprésentes dans les laboratoires pour une grande variété de techniques, telles que l’électroporation de cellule unique, la micro-injection d’ADN et l’électrophysiologie du patch clamp Pour préparer des électrodes de patch clamp en verre pour les enregistrements ou le verre de silicate est tiré sur une polaire programmable. Les pointes des électrodes sont recouvertes de cire, puis les pointes sont polies au feu et stockées pour une utilisation future. Bonjour, je m’appelle Miriam Goodman et je travaille au Département de physiologie moléculaire et cellulaire de l’Université de Stanford.

Dans cette vidéo, je vais montrer comment fabriquer des pipettes patch clamp et des électrodes pointues pour l’électrophysiologie. Les micro-électrodes en verre, également appelées pipettes, sont un cheval de bataille de l’électrophysiologie depuis des décennies. Aujourd’hui, ces pipettes sont fabriquées à partir de capillaires en verre à l’aide d’une traction programmable.

Alors commençons. Pour fabriquer des pipettes à pince patch, nous utilisons de la soie de sanglier Sutter dans des capillaires propres et sans poussière, et nous utilisons l’extracteur de micro-électrodes à terre flamboyante Sutter P nine nine. Le livre de recettes des pipettes de Sutter est une excellente référence pour le développement de programmes de tirage appropriés.

Pour commencer, soulevez le couvercle anti-poussière de l’extracteur. Prenez ensuite un tube capillaire en verre de la boîte. Assurez-vous de replacer le couvercle pour minimiser l’accumulation de poussière.

Ensuite, d’une main, faites glisser le capillaire dans la rainure d’un côté du filament, serrez légèrement la pince. À ce stade, la pince doit être suffisamment serrée pour empêcher le tube de tomber, mais suffisamment lâche pour que vous puissiez la glisser dans la rainure. Maintenant, relâchez la butée métallique du ressort du même côté.

Ensuite, avec votre pouce et votre index, saisissez les languettes métalliques qui sont fixées au bas des deux supports. Relâchez l’autre butée métallique du ressort. Tirez les supports ensemble aussi loin que possible et maintenez-les en place d’une main.

Ensuite, faites glisser le tube à travers le boîtier du filament dans la rainure du support de l’autre côté. Évitez d’enfoncer le verre dans le filament chauffant. Serrez les pinces des deux côtés.

Ils doivent être suffisamment serrés pour maintenir les supports en place, mais pas trop serrés pour que le verre soit écrasé. Maintenant, fermez le couvercle anti-poussière et appuyez sur le bouton vert. Les pipettes à pôles marqués pour l’enregistrement à l’aide d’un patch clamp sont formées à l’aide d’un programme d’interrogation en cinq étapes avec une baisse de la chaleur et de la vitesse à chaque étape et une petite perche à l’étape finale.

Ce programme utilise la chaleur et la gravité. La procédure de fabrication d’électrodes tranchantes est très similaire, mais dans ce cas, nous utilisons le capillaire en verre mince de Warner Instruments qui a un diamètre extérieur d’un millimètre et un diamètre intérieur de 0,78 millimètre. Nous appliquons également un programme de traction qui utilise un moteur en plus de la chaleur et de la gravité lorsque les programmes de traction sont terminés.

Soulevez le couvercle anti-poussière, desserrez les deux pinces et retirez la pipette finie. Ensuite, placez les pipettes dans une boîte de travail. La boîte peut être fabriquée en collant une bande de mousse sur le support d’une boîte en plastique à pointes de pipette, puis en découpant six à huit fentes dans la mousse.

Insérez les pipettes dans les fentes. Une fois que la boîte est pleine de pipettes tirées, passez à l’étape de polissage au feu pour polir les pipettes. Installez un rig de micro-forge avec un filament chauffant en platine contrôlé par une pédale avant de commencer le polissage au feu.

Enduisez d’abord la pipette de cire dentaire pour réduire la capacité et améliorer les caractéristiques sonores. Pour ce faire, gardez une petite réserve de cire fondue à proximité. Appliquez une pression d’air à l’arrière de la pipette pour empêcher la cire de pénétrer dans l’embout.

Trempez ensuite brièvement la pointe dans la cire liquide. Et supprimer maintenant. Placez la pipette dans l’appareil de polissage et amenez la pointe à environ 50 microns du filament.

Gardez à l’esprit que le filament se dilate lorsqu’il est chauffé. Appliquez une brève impulsion de chaleur d’une ou deux secondes pour retirer la cire de l’extrémité de la pipette et lisser le verre. Examinez les pointes de pipette au microscope pour déterminer le diamètre et la douceur de l’ouverture.

Pour les enregistrements par patch clamp standard, les ouvertures des pointes doivent avoir un à trois microns de diamètre, être jetées, rugueuses, inégales ou irrégulières. Placez la pipette finie dans une boîte de travail, en veillant à fermer le couvercle pour protéger les pipettes de la poussière répéter pour 10 pipettes réussies. Je viens de vous montrer comment fabriquer des pipettes patch clamp et des électros pointus à l’aide d’un extracteur programmable.

La même procédure peut être utilisée pour fabriquer une variété d’outils en verre, y compris des aiguilles d’injection pour des résultats optimaux de patch clamp. Il est important de ne pas oublier de tirer les nouvelles pipettes sans poussière le jour même de l’expérience et de les polir dans l’heure qui suit l’expérience. Vérifiez également par inspection que les pipettes sont lisses et polies.

Assurez-vous de regarder notre autre vidéo, qui montre comment effectuer l’enregistrement par patch clamp des canaux ioniques exprimés dans les ovocytes opus. D’accord, c’est tout. Vous êtes maintenant un expert en pipettes et bonne chance pour vos expériences.