Name: Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Apprenez à préparer des pipettes patch-clamp et des électrodes pointues pour l'électrophysiologie en utilisant un tireur programmable. Cette méthode permet de créer des outils essentiels pour l'étude des signaux électriques cellulaires.

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Nous remercions les organismes de financement et fondations suivantes pour le soutien: National Institutes of Health, National Science Foundation, l&#39;American Heart Association, la Muscular Dystrophy Association, le B. Donald E. Baxter et Delia Fondation, le Fonds de dotation et les Klingenstein McKnight for Neuroscience.

Pipettes de traction En utilisant une microélectrode extracteur comme le Sutter P-97 Flaming / Brown, tirer un ensemble d&#39;environ 10-20 pipettes. <ol><li> Sélectionnez votre verre capillaire. Nous utilisons borosilicate capillaires (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm de diamètre extérieur, diamètre intérieur de 1.1mm, 10cm de long). Conservez le verre avec soin afin qu&#39;il reste propre et sans poussière. </li><li> Concevoir un programme de traction. Nous utilisons un programme en 5 étapes, avec la chaleur et la vitesse de descente à chaque étape, et une traction sur la petite la dernière étape. Livre de Sutter pipette est une excellente référence pour l&#39;élaboration de programmes appropriés. </li><li> Examiner les embouts de pipette sous un microscope pour déterminer le diamètre d&#39;ouverture et de douceur. Jeter rugueux, inégaux des conseils, ou irrégulière. Un bon protocole tirant devrait s&#39;assurer qu&#39;ils sont rares. Pour la norme patch-clamp, les ouvertures de pointe doit être microns 1-3 dans diamètre. Un cône fort (émoussé la pointe) entraîne une diminution de résistance pour le diamètre même ouverture. La forme et la taille peut être modifiée par le polissage de pression. </li></ol> Pipettes de polissage au feu <ol><li> Mettre en place une plate-forme de polissage (microforge) avec un filament de chauffage de platine contrôlés par une pédale. Un kit utile est disponible à partir ALA scientifique (CPM-2) ou un appareil similaire peut être assemblé au coup par coup. </li><li> En option: Manteau de la pipette avec un isolant pour diminuer la capacité et améliorer les caractéristiques de bruit. Nous utilisons de la cire dentaire. Sylgard 184 ™ (poly-diméthyl siloxane élastomère également connu comme PDMS) est également une option. </li><li> Si vous utilisez de la cire, garder une petite réserve fondue à proximité. Avec une pression d&#39;air sur le dos de la pipette pour garder la cire d&#39;entrer dans la pipette, tremper brièvement pointe dans la cire liquide et à enlever. Avec Sylgard, stocker élastomère préparé en aliquots congelés et peindre la pointe de la pipette sous un microscope. Chauffer pour guérir l&#39;élastomère. </li><li> Placez la pipette (couché ou non) dans l&#39;appareil de polissage et de mettre le bout ~ 50 microns à partir du filament. Gardez à l&#39;esprit que le filament se développer lorsqu&#39;il est chauffé. </li><li> Recommandé: Suivez le protocole distinct pour &quot;polir la pression&quot; pour changer la forme de la pipette pour une résistance optimale et diamètre de la pointe. </li><li> Une brève impulsion de chaleur (1-2 secondes) est suffisant pour enlever la cire de la pointe de la pipette et lisse du verre. </li><li> Placez la pipette fini dans une boîte fermée à l&#39;abri de la poussière, répétez l&#39;opération pour 10 pipettes de succès. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Le protocole est illustré ici, dans une utilisation quotidienne dans les laboratoires d&#39;électrophysiologie et est également utilisé pour faire des aiguilles d&#39;injection pour les cellules et les animaux. Avec un extracteur programmables, il est facile de faire des pipettes pour une variété d&#39;utilisations. Avec une attention et des soins, le filament sur votre extracteur va durer un an ou plus. Bonne chance avec vos expériences.

<table><tbody><tr><td>Micro-pipeteuse</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Ou un instrument similaire (par exemple Sutter P-87 ou P-2000)</td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>Réactif</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>Ou un verre capillaire similaire. Pour faciliter le remplissage de la pipette, utilisez un capillaire avec un filament de verre.</td></tr></tbody></table>

faire patch pipettes et électrodes sharp avec un extracteur programmable

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Microélectrodes de verre (aussi appelé pipettes) ont été un cheval de bataille de l&#39;électrophysiologie pendant des décennies. Aujourd&#39;hui, ces pipettes sont fabriqués à partir de capillaires en verre à l&#39;aide d&#39;un tire-programmables. Ces instruments de la chaleur du capillaire en utilisant soit un filament métallique ou d&#39;un laser et d&#39;en tirer le verre en utilisant la gravité, un moteur ou les deux. Pipettes pour patch-clamp sont formées en utilisant la chaleur et ne la gravité, tandis que des électrodes pour l&#39;enregistrement intracellulaire forte d&#39;utiliser une combinaison de la chaleur, la pesanteur, et un moteur. La procédure utilisée pour faire des pipettes d&#39;enregistrement intracellulaire est semblable à celui utilisé pour faire des aiguilles d&#39;injection pour une variété d&#39;applications, y compris l&#39;injection dans des ovocytes de Xenopus ARNc. En général, capillaire en verre &lt;1,2 mm de diamètre est utilisé pour faire des pipettes pour l&#39;enregistrement de patch-clamp, tandis que plus étroit de verre est utilisé pour l&#39;enregistrement intracellulaire (diamètre extérieur = 1,0 mm). Pour chaque outil, l&#39;extracteur est programmé de façon légèrement différente. Cette vidéo montre comment faire les deux types de pipettes d&#39;enregistrement en utilisant des programmes pré-établis extracteur.

Cette vidéo montre comment utiliser un tire-programmables pour les pipettes de patch et électrodes pointu pour l&#39;électrophysiologie. La même procédure peut être utilisée pour faire une variété d&#39;outils de verre, y compris les aiguilles d&#39;injection.

Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable

Les microélectrodes en verre (également appelées pipettes) sont un outil fondamental de l'électrophysiologie depuis des décennies. Aujourd'hui, ces pipettes sont fabriquées à partir de capillaires en verre...

Les pipettes capillaires en verre sont devenues omniprésentes dans les laboratoires pour une grande variété de techniques, telles que l'électroporation de cellule unique, la microinjection d'ADN et l'électrophysiologie en configuration de patch. Pour préparer des électrodes en verre capillaire pour des enregistrements en configuration de patch, on tire du verre silicaté sur un tireur programmable. Les extrémités des électrodes sont enduites de cire, puis polies à la flamme et stockées pour une utilisation ultérieure. Bonjour, je suis Miriam Goodman du Département de physiologie moléculaire et cellulaire de l'Université Stanford.Dans cette vidéo, je vais montrer comment fabriquer des pipettes pour la technique du patch clamp et des électrodes pointues destinées à l'électrophysiologie. Les microélectrodes en verre, également appelées pipettes, sont un outil fondamental de l'électrophysiologie depuis des décennies. Aujourd'hui, ces pipettes sont réalisées à partir de capillaires en verre à l'aide d'un tireur programmable.Commençons donc. Pour fabriquer des pipettes de patch clamp, nous utilisons des capillaires en verre borosilicate Sutter exempts de poussière et propres, ainsi qu’un

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Ceci est un guide pour modifier la forme de micropipettes de verre. Plus précisément, en utilisant la chaleur et la pression d'air du cône est élargi sans pour autant augmenter l'ouverture astuce, conduisant à une plus faible résistance pipette. Cela est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit de petites cellules, mais est utile dans de nombreuses applications.

Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp

Bicouches lipidiques planes, aussi appelé bicouches lipidiques artificielles, vous permettent d'étudier les canaux ioniques mener dans un environnement bien défini. Ici, nous démontrons les différentes étapes nécessaires pour préparer la chambre de bicouche, les électrodes et comment tester que le bicouche est adapté à un seul canal de mesure.

Préparation de bicouches artificielle pour des expériences d&#39;électrophysiologie

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour mesurer la rigidité cellulaire. Le principe général de cette approche consiste à mesurer déformation de la membrane en réponse à bien défini pression négative appliquée par le biais d'une micropipette à la surface cellulaire. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier les propriétés biomécaniques du substrat-jointes cellules.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Iontophorèse d'agonistes et des antagonistes de neurones au cours...

Fabrication et utilisation de ferroutage Multibarrel Électrodes pour<em&gt; In vivo</em&gt; Manipulations pharmacologiques des réponses de neurones

Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l'automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d'accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d'enregistrements.

Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

Canaux mécanosensibles bactériennes peuvent être utilisés comme capteurs dans des dispositifs mécano biomoléculaires. Bicouches gouttelettes d'interface (DIB), blocs de construction inspiré de cellule à ces dispositifs, représentent de nouvelles plateformes pour intégrer et stimuler les canaux mécanosensibles. Ici, nous démontrons une nouvelle méthode de formation de DIB, permettant l'étude des canaux mécanosensibles sous stimulation mécanique basé micropipette.

Multifonctionnel, Micropipette à base Méthode de constitution et la stimulation de la société Bacterial mécanosensible Canaux ioniques en gouttelettes interface Bilayers

Nous présentons des méthodes de construction d’électrodes pour enregistrer simultanément l’activité neuronale extracellulaire et libérer plusieurs substances neuroactives au voisinage des sites d’enregistrement chez les souris éveillées. Cette technique permet l’analyse détaillée des entrées synaptiques locales présumées vers le neurone d’intérêt.

Extracellulaires enregistrement de l&#39;activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

Ce protocole décrit comment mener des expériences automatiques de fixation de patch guidées par image à l'aide d'un système récemment développé pour un équipement d'électrophysiologie standard in vitro .

Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l&#39;étude des neurones dans les tranches de cerveau

Nous décrivons un protocole pour surveiller des changements de l’activité afférente de neurone pendant des commandes de moteur dans un système de cellules de cheveux vertébré modèle.

Activité des neurones afférents de la ligne latérale postérieure pendant la baignade chez le poisson zèbre

Ce protocole détaille une méthode permettant de mesurer directement l’activité des canaux ioniques sur les vésicules intracellulaires à l’aide d’un système manuel de patch-clamp endolysosomal. Nous illustrons la méthode qui consiste à agrandir les endolysosomes et à isoler manuellement ces vésicules. Cette approche permet aux chercheurs de reproduire et d’appliquer avec précision la procédure.

Techniques de patch-clamp pour l’analyse d’une vésicule endolysosomale unique

Apprenez à préparer des pipettes patch-clamp et des électrodes pointues pour l'électrophysiologie en utilisant un tireur programmable. Cette méthode permet de créer des outils essentiels pour l'étude des signaux électriques cellulaires.

Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable

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