Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp
22 octobre 2008
Ceci est un guide pour modifier la forme de micropipettes de verre. Plus précisément, en utilisant la chaleur et la pression d'air du cône est élargi sans pour autant augmenter l'ouverture astuce, conduisant à une plus faible résistance pipette. Cela est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit de petites cellules, mais est utile dans de nombreuses applications.
Cette procédure commence par positionner l'embout de la pipette près du filament de polissage à un grossissement de 100 fois. Ensuite, activez la pression d'air et la chaleur. Le filament.
La pointe de pipette va s'élargir pour former une extrémité émoussée. Éteignez la chaleur pour obtenir une ouverture plus petite. Éteignez à nouveau la pression et la chaleur.
Bonjour, je suis Brandon Johnson du laboratoire de la Dre Miriam Goodman, du Département de physiologie moléculaire et cellulaire de l'Université Stanford. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de polissage sous pression des micropipettes pour la technique de patch. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les canaux ioniques, les membranes et les neurones NC elgan.
Commençons donc. Prélevez un jeu de six à dix micropipettes pour enregistrement. Consultez un expert local ou notre expérience illustrée sur la fabrication de micropipettes pour enregistrement et d'électrodes pointues à l'aide d'un tireur de pipettes programmable pour obtenir de l'aide.
Pour commencer la procédure, régler la pression d’alimentation pneumatique comprimée à environ 40 lb/po². Ensuite, raccorder l’alimentation pneumatique comprimée à une vanne de commande quadriviale. Raccorder un tronçon de tube en plastique à la vanne quadriviale et fixer un support de pipette haute pression à l’extrémité libre du tube en plastique. Utiliser un dispositif de microfusion pour effectuer le polissage.
Nous utilisons le kit Ccpm deux de LA Scientific. Ce dispositif comprend un porte-pipette à haute pression, un filament chauffant en platine commandé par une pédale et un microscope équipé d'objectifs à faible et forte puissance, respectivement 10 fois et 100 fois. Des objectifs à distance de travail en air sont idéaux, car il est essentiel de pouvoir observer l'ouverture de la pipette durant le protocole.
Ensuite, vérifiez que la vanne de pression est en position fermée. Puis insérez une pipette dans le support de pipette et serrez le raccordement à la main jusqu'à ce qu'il soit bien fixé, pour la sécurité en laboratoire. Assurez-vous que la pipette est solidement maintenue dans son support.
Sinon, la pression de l'air provoquera l'éjection de la pipette du porte-pipette. En tant qu'étape facultative, vous pouvez recouvrir la pipette d'un isolant hydrophobe tel que de la cire afin de réduire la capacitance et d'améliorer les caractéristiques de bruit. Placez maintenant la pipette dans le porte-pipette sur la position du micro-foret, puis positionnez le porte-pipette sur la platine du microscope de manière à ce que la pointe et le filament de polissage soient visibles en faible grossissement (×10) sur le micro-foret.
Rapprochez la pointe à environ 50 microns du filament, puis passez à l'objectif de haute puissance 100. La pointe de la pipette et le filament de polissage doivent être au point et dans le champ de vision. Sinon, ajustez la hauteur du filament. Étant donné que la position de la pipette ne peut pas être modifiée, la pointe de la pipette et le filament doivent se trouver de part et d'autre du champ de vision.
Évitez de positionner la pointe de la pipette trop près du filament, car celui-ci s'étendra lorsqu'il sera chauffé et pourrait entrer en contact avec votre pipette. Une fois la pointe et le filament correctement positionnés, tournez le robinet afin d'envoyer de l'air sous pression dans la pipette et chauffez la pointe de la pipette jusqu'à ce que la zone conique située derrière la pointe commence à gonfler vers l'extérieur. Arrêtez le chauffage avant que la pointe ne gonfle excessivement.
Des expérimentations sont nécessaires pour déterminer la distance, la chaleur et le temps appropriés afin d'obtenir la forme souhaitée. En tant qu'étape facultative, vous pouvez également polir la pointe en l'absence de pression afin de réduire le diamètre de l'ouverture de la pointe. De plus, gardez à l'esprit que ces étapes de polissage peuvent être répétées pour affiner le résultat.
Réglez à la fois la forme et les dimensions de la pointe de pipette. Lorsque le polissage est terminé, éteignez la pression et dirigez la pointe de pipette dans une direction sécurisée.
Retirez la pipette et placez-la dans une boîte de rangement propre où elle sera protégée de la poussière. Pour la sécurité du laboratoire, assurez-vous de couper la pression avant de retirer la pipette. Sinon, elle pourrait être éjectée du support de pipette.
Après le retrait, nous venons de vous montrer comment polir sous pression des pipettes afin d'améliorer les enregistrements en enregistrement de patch. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de recouvrir la bobine de polissage d'un verre à haute température de fusion afin de minimiser le dépôt de métal vaporisé sur les pipettes, et de faire preuve de prudence lorsque les pipettes sont exposées à de l'air sous pression.
Veillez à ce que la pipette soit fermement maintenue dans le support et à couper l'air avant de retirer la pipette du support. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé.
Bonne polissage sous pression et bonne chance avec vos expériences.
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Aperçu
Ce guide décrit la modification de la forme des micropipettes en verre à l'aide de chaleur et de pression d'air. Ce procédé permet d'élargir la zone conique sans augmenter l'ouverture de la pointe, ce qui est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit dans les applications sur cellules de petite taille.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Électrophysiologie
- Confection de micropipettes
Contexte
- Les micropipettes en verre sont des outils essentiels pour les enregistrements électrophysiologiques.
- Une résistance plus faible de la pipette est nécessaire pour obtenir des enregistrements de haute qualité.
- La modification de la forme peut améliorer les performances dans diverses applications.
- Cette technique est particulièrement avantageuse pour l'enregistrement de cellules petites.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode pour façonner des micropipettes en verre.
- Réduire la résistance de la pipette sans agrandir l'ouverture de la pointe.
- Améliorer la qualité des enregistrements provenant de cellules petites.
Méthodes utilisées
- Positionner la pointe de pipette près d'un filament de polissage à fort grossissement.
- Appliquer une pression d'air et de la chaleur pour dilater la pointe de pipette.
- Éteindre la chaleur afin d'obtenir une ouverture plus petite à la pointe.
- Ajustements finaux en coupant la pression et la chaleur.
Résultats principaux
- La pointe de pipette peut être remodelée efficacement en une forme émoussée.
- Une résistance plus faible est obtenue sans augmentation de la taille de la pointe.
- Cette méthode améliore la qualité de l'enregistrement provenant de cellules petites.
- Démontre une approche pratique pour la modification de micropipettes.
Conclusions
- La confection de micropipettes en verre est une technique précieuse dans la recherche en neurosciences.
- Une conception améliorée des pipettes conduit à une meilleure qualité des données.
- Cette méthode peut être appliquée dans diverses études électrophysiologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le polissage sous pression des pipettes réduit la résistance électrique dans les enregistrements en configuration patch sans modifier le diamètre de la pointe, permettant des mesures d'ions canaux de meilleure fidélité à partir de petites populations neuronales. Cette amélioration technique soutient la validation des cibles en découverte de médicaments en neurosciences en améliorant les rapports signal/bruit dans les essais électrophysiologiques. Une qualité d'enregistrement accrue augmente la fiabilité prédictive des études mécanistiques précoces de l'excitabilité neuronale et de la fonction synaptique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la fonction des canaux ioniques dans les neurones de petit diamètre, essentiels pour les cibles de la douleur neuropathique et de l'épilepsie.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité des enregistrements unitaires en minimisant le bruit induit par la pipette.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des géométries de pipette standardisées pour des panels de criblage électrophysiologique reproductibles.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les micropipettes en verre mou et dur, permettant une conception d'essai souple pour différentes classes de cibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Soutient les applications du patch-clamp perforé en générant des pointes émoussées qui augmentent la formation de vésicules membranaires pour les perforants antibiotiques.
- Valeur opérationnelle : Prolonge la durée d'enregistrement dans les cultures neuronales primaires, améliorant ainsi le débit pour les études d'optimisation des candidats médicaments.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, où le phénotypage électrophysiologique oriente la sélection de la cible et le profilage des composés leaders.
- Biologie de la découverte : Permet la validation fonctionnelle de cibles de canaux ioniques dans des modèles neuronaux pertinents pour la maladie.
- Criblage : Fournit des pipettes à faible résistance pour un criblage de composés de haute fidélité sur des plateformes de patch-clamp.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives des courants et de la conductance avec une stabilité du signal améliorée.
- Recherche translationnelle : Facilite l’enregistrement longitudinal dans des tranches aiguës et des neurones en culture pour la modélisation pharmacocinétique-pharmacodynamique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Nécessite uniquement une mise à niveau par microforge, ce qui en fait une amélioration évolutive et peu coûteuse de l'infrastructure existante en électrophysiologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles grâce à des phénotypes électrophysiologiques plus précis.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité des tests entre sites et opérateurs en standardisant la géométrie des pipettes.
- Valeur stratégique : Réduit les faux négatifs dans le criblage des canaux ioniques en minimisant le bruit technique.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant dans les programmes précliniques ciblant l'excitabilité neuronale.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de micropipettes et en électrophysiologie.
- Requiert un microforge équipé d'une vanne à haute pression, d'un filament chauffant et d'optiques de grossissement.
- Exige une standardisation des paramètres de pression, de chaleur et de durée entre les utilisateurs.
- Doit tenir compte des différences de type de verre (verre sodocalcique par rapport au verre borosilicaté) dans la réponse au polissage.
- Est limité par la nécessité d'un positionnement manuel de la pointe et de compétences opératoires pour éviter une sur-expansion.
