Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp
22 octobre 2008
Ceci est un guide pour modifier la forme de micropipettes de verre. Plus précisément, en utilisant la chaleur et la pression d'air du cône est élargi sans pour autant augmenter l'ouverture astuce, conduisant à une plus faible résistance pipette. Cela est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit de petites cellules, mais est utile dans de nombreuses applications.
Cette procédure commence par le positionnement de la pointe de la pipette près du filament de polissage à un grossissement de 100 fois. Ensuite, allumez la pression de l’air et le chauffage. Le filament.
La pointe de la pipette s’élargit pour former une pointe en forme d’émoussé. Éteignez le feu pour obtenir une ouverture de pointe plus petite. Coupez la pression et chauffez à nouveau.
Bonjour, je m’appelle Brandon Johnson et je travaille dans le laboratoire de Miriam Goodman au Département de physiologie moléculaire et cellulaire de l’Université de Stanford. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de polissage sous pression des pipettes de patch. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les canaux ioniques et les patchs membranaires et les neurones ELGAN NC.
Alors commençons. Tirez un ensemble de six à 10 pipettes patch. Pour obtenir de l’aide, consultez un expert local ou notre expérience visualisée de fabrication de pipettes patch et d’électrodes pointues avec une polaire programmable.
Pour commencer la procédure, réglez une pression d’air comprimée à environ 40 PS. Je connecte ensuite l’air comprimé à une vanne de régulation à quatre voies. Connectez une longueur de tube en plastique à la vanne à quatre voies et fixez un support de pipette haute pression à l’extrémité libre du tube en plastique. Utilisez une plate-forme de micro-forge pour effectuer le polissage.
Nous utilisons le kit Ccpm two d’un LA Scientific. Ce rig dispose d’un porte-pipette haute pression, d’un filament chauffant en platine contrôlé par une pédale et d’un microscope équipé d’un grossissement faible et élevé 10 fois en 100 fois long. Les objectifs aériens de distance de travail sont idéaux car il est essentiel de pouvoir observer l’ouverture de la pipette pendant le protocole.
Ensuite, vérifiez que la soupape de pression est en position d’arrêt. Placez ensuite une pipette dans le support de pipette et serrez le raccord pour le serrer à la main pour la sécurité du laboratoire. Assurez-vous que la pipette est fermement maintenue dans le porte-pipette.
Sinon, la pression de l’air entraînera l’éjection de la pipette du support. En option, vous pouvez enduire la pipette d’un isolant hydrophobe tel que de la cire pour réduire la capacité et améliorer les caractéristiques sonores. Placez maintenant le support de pipette dans la micro-forge, positionnez le support de pipette sur la platine du microscope de manière à ce que la pointe et le filament de polissage soient visibles à faible puissance 10 fois sur la micro-forge.
Amenez la pointe à environ 50 microns du filament, puis passez à l’objectif haute puissance 100, la pointe de la pipette et le filament de polissage doivent être nets et dans le champ de vision. Si ce n’est pas le cas, ajustez la hauteur du filament. Comme la position de la pipette ne peut pas être ajustée, la pointe et le filament de la pipette doivent se trouver de part et d’autre du champ de vision.
Évitez de positionner la pointe de la pipette trop près du filament, car elle se dilatera en chauffant et pourrait heurter votre pipette. Une fois que la pointe et le filament sont correctement positionnés, tournez la valve afin de diriger l’air sous pression dans la pipette et chauffez la pointe de la pipette jusqu’à ce que le cône derrière la pointe commence à gonfler vers l’extérieur. Arrêtez le chauffage avant que la pointe ne gonfle trop largement.
Des expérimentations sont nécessaires pour déterminer la distance, la chaleur et le temps appropriés pour la forme souhaitée. En option, vous pouvez également polir l’embout en l’absence de pression afin de réduire le diamètre d’ouverture de l’embout. Gardez également à l’esprit que ces étapes de polissage peuvent être répétées très finement.
Ajustez à la fois la forme et les dimensions de la pointe de la pipette. Lorsque le polissage est terminé. Coupez le point de pression de la pointe de la pipette dans une direction sûre.
Retirez la pipette et placez-la dans une boîte de rangement propre où elle sera protégée de la poussière. Pour la sécurité du laboratoire, assurez-vous de couper la pression avant de retirer la pipette. Sinon, il peut être éjecté du porte-pipette.
Une fois retirés, nous venons de vous montrer comment polir les pipettes sous pression pour améliorer les enregistrements de patch-clamps. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de recouvrir la bobine de polissage de verre à haute température de fusion afin de minimiser le dépôt de métal vaporisé sur les pipettes. Et de faire preuve de prudence lorsque les pipettes sont exposées à de l’air sous pression.
Assurez-vous que la pipette est fermement maintenue dans le support et coupez l’air avant de retirer la pipette du support. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé.
Bon polissage sous pression et bonne chance pour vos expériences.
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Aperçu
Ce guide décrit la modification de la forme des micropipettes en verre à l'aide de chaleur et de pression d'air. Ce procédé permet d'élargir la zone conique sans augmenter l'ouverture de la pointe, ce qui est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit dans les applications sur cellules de petite taille.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Électrophysiologie
- Confection de micropipettes
Contexte
- Les micropipettes en verre sont des outils essentiels pour les enregistrements électrophysiologiques.
- Une résistance plus faible de la pipette est nécessaire pour obtenir des enregistrements de haute qualité.
- La modification de la forme peut améliorer les performances dans diverses applications.
- Cette technique est particulièrement avantageuse pour l'enregistrement de cellules petites.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode pour façonner des micropipettes en verre.
- Réduire la résistance de la pipette sans agrandir l'ouverture de la pointe.
- Améliorer la qualité des enregistrements provenant de cellules petites.
Méthodes utilisées
- Positionner la pointe de pipette près d'un filament de polissage à fort grossissement.
- Appliquer une pression d'air et de la chaleur pour dilater la pointe de pipette.
- Éteindre la chaleur afin d'obtenir une ouverture plus petite à la pointe.
- Ajustements finaux en coupant la pression et la chaleur.
Résultats principaux
- La pointe de pipette peut être remodelée efficacement en une forme émoussée.
- Une résistance plus faible est obtenue sans augmentation de la taille de la pointe.
- Cette méthode améliore la qualité de l'enregistrement provenant de cellules petites.
- Démontre une approche pratique pour la modification de micropipettes.
Conclusions
- La confection de micropipettes en verre est une technique précieuse dans la recherche en neurosciences.
- Une conception améliorée des pipettes conduit à une meilleure qualité des données.
- Cette méthode peut être appliquée dans diverses études électrophysiologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le polissage sous pression des pipettes réduit la résistance électrique dans les enregistrements en configuration patch sans modifier le diamètre de la pointe, permettant des mesures d'ions canaux de meilleure fidélité à partir de petites populations neuronales. Cette amélioration technique soutient la validation des cibles en découverte de médicaments en neurosciences en améliorant les rapports signal/bruit dans les essais électrophysiologiques. Une qualité d'enregistrement accrue augmente la fiabilité prédictive des études mécanistiques précoces de l'excitabilité neuronale et de la fonction synaptique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la fonction des canaux ioniques dans les neurones de petit diamètre, essentiels pour les cibles de la douleur neuropathique et de l'épilepsie.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité des enregistrements unitaires en minimisant le bruit induit par la pipette.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des géométries de pipette standardisées pour des panels de criblage électrophysiologique reproductibles.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les micropipettes en verre mou et dur, permettant une conception d'essai souple pour différentes classes de cibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Soutient les applications du patch-clamp perforé en générant des pointes émoussées qui augmentent la formation de vésicules membranaires pour les perforants antibiotiques.
- Valeur opérationnelle : Prolonge la durée d'enregistrement dans les cultures neuronales primaires, améliorant ainsi le débit pour les études d'optimisation des candidats médicaments.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, où le phénotypage électrophysiologique oriente la sélection de la cible et le profilage des composés leaders.
- Biologie de la découverte : Permet la validation fonctionnelle de cibles de canaux ioniques dans des modèles neuronaux pertinents pour la maladie.
- Criblage : Fournit des pipettes à faible résistance pour un criblage de composés de haute fidélité sur des plateformes de patch-clamp.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives des courants et de la conductance avec une stabilité du signal améliorée.
- Recherche translationnelle : Facilite l’enregistrement longitudinal dans des tranches aiguës et des neurones en culture pour la modélisation pharmacocinétique-pharmacodynamique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Nécessite uniquement une mise à niveau par microforge, ce qui en fait une amélioration évolutive et peu coûteuse de l'infrastructure existante en électrophysiologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles grâce à des phénotypes électrophysiologiques plus précis.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité des tests entre sites et opérateurs en standardisant la géométrie des pipettes.
- Valeur stratégique : Réduit les faux négatifs dans le criblage des canaux ioniques en minimisant le bruit technique.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant dans les programmes précliniques ciblant l'excitabilité neuronale.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de micropipettes et en électrophysiologie.
- Requiert un microforge équipé d'une vanne à haute pression, d'un filament chauffant et d'optiques de grossissement.
- Exige une standardisation des paramètres de pression, de chaleur et de durée entre les utilisateurs.
- Doit tenir compte des différences de type de verre (verre sodocalcique par rapport au verre borosilicaté) dans la réponse au polissage.
- Est limité par la nécessité d'un positionnement manuel de la pointe et de compétences opératoires pour éviter une sur-expansion.
