Name: protein purification with sec and imac
Uploaded: 2023-04-30T06:30:54.000Z
Duration: 7 min 51 s
Channel: JoVE

K12 Standards

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

High School

Life Science

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Chromatography-based Biomolecule Purification Methods

בביוכימיה, שיטות טיהור מבוססות כרומטוגרפיה משמשות כדי לבודד תרכובות מתערובת מורכבת. שתי שיטות כאלה המשמשות בדרך כלל על ידי ביוכימאים הן כרומטוגרפיה גודל-הדרה וכרומטוגרפיה זיקה. בכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, עמודה עמוסה חרוזים נקבוביים מפרידה בין רכיבים של תערובת בהתבסס על גודל. מצד שני, כרומטוגרפיה של זיקה מאפשרת הפרדה ספציפית יותר של ביומולקולים באמצעות עמודה המורכבת משלב נייח, המכיל ליגנדים ספציפיים למטרה.
וידאו זה משמש מבוא לכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל וזיקה, כמו גם למושגים השולטים בהם. הליך שלב אחר שלב לטיהור של חלבון מתויג היסטידין על ידי כרומטוגרפיה זיקה מתכתית משותקת מתואר. יישומים עבור שתי שיטות כרומטוגרפיות אלה בביוכימיה ומחקר ביו-רפואי הם גם פרופיל.

שיטות טיהור ביומולקול מבוססות כרומטוגרפיה

בביוכימיה, שיטות טיהור מבוססות כרומטוגרפיה משמשות כדי לבודד תרכובות מתערובת מורכבת. שתי שיטות כאלה המשמשות בדרך כלל על ידי ביוכימאים הן כרומטוגרפיה גודל-הדרה וכרומטוגרפיה זיקה. בכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, עמודה עמוסה חרוזים נקבוביים מפרידה בין רכיבים של תערובת בהתבסס על גודל. מצד שני, כרומטוגרפיה של זיקה מאפשרת הפרדה ספציפית יותר של ביומולקולים באמצעות עמודה המורכבת משלב נייח, המכיל ליגנדים ספציפיים למטרה.
וידאו זה משמש מבוא לכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל וזיקה, כמו גם למושגים השולטים בהם. הליך שלב אחר שלב לטיהור של חלבון מתויג היסטידין על ידי כרומטוגרפיה זיקה מתכתית משותקת מתואר. יישומים עבור שתי שיטות כרומטוגרפיות אלה בביוכימיה ומחקר ביו-רפואי הם גם פרופיל.
<div class="chapter_text" id="script_0">
"כרומטוגרפיה" מתייחס למגוון רחב של שיטות המשמשות לבידוד רכיב מתערובת מורכבת, צעד חיוני לפני שניתן לקבוע את תכונותיו ופעילותו של הביו-מוקולקול. לכל טכניקה כרומטוגרפית יש מנגנון שונה להפרדה, בהתאם למטריקס לדוגמה ולתרכובת היעד. וידאו זה יתמקד בעקרונות ובתפעול של שתי שיטות המשותפות לביוכימיה: מידה-הדרה וכרומטוגרפיה של זיקה.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל או SEC מבוססת על גודל התרכובות במדגם. שלב נייד המכיל את המדגם נוסף לעמודה עם חומר נקבובי: השלב הנייח. המולקולות במדגם מתחלקות ל-1 מתוך 3 קטגוריות.
מולקולות גדולות מכדי להיכנס לנקבוביות נעות במרחק הקצר ביותר דרך העמוד. כל מין עם משקל מולקולרי מעל "מגבלת אי הכללה" זו ייצא מהטור בו זמנית. מולקולות קטנות מספיק כדי להיכנס בחופשיות לנקבוביות יישמרו הכי הרבה זמן, ויצאו מהטור יחד. המשקל המולקולרי המאפשר כניסת נקבובית מלאה הוא "מגבלת החלחלות".
רק מולקולות בין גבולות אלה יופרדו זו מזו, שכן הן מבלות כמויות משתנות של זמן בהתפזרות לתוך הנקבוביות ומחוצה להן. מולקולות קטנות יותר נשמרות זמן רב יותר על העמודה מכיוון שהן מבלות יותר זמן בשלב הנייח, בעוד שמולקולות גדולות יותר בגבולות אלה יוצאות מוקדם יותר.
משקלים מולקולריים על פני 1 עד 2 סדרי גודל נופלים בגבולות אלה. עמודות נבחרות מתוך מחשבה זו, או שניתן להשתמש בעמודות מרובות בסידרה אם קיים מגוון רחב של תרכובות רצויות.
עכשיו שראיתם את התיאוריה של הרשות לניירות ערך, בואו נראה איך זה מתבצע.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
כדי להתחיל בהליך ה- SEC, יש לשקם את העמודה עם מאגר מים וכרומטוגרפיה דה-יונים. לאחר ההכנה, המאגר המכיל את המדגם מוזרק לעמודה. לאחר מכן, המאגר נדחף פנימה בקצב זרימה נמוך. גלאי מנטר את היציאה מהעמודה כדי לקבוע את נוכחות הניתוח הרצוי. מולקולות גדולות עם משקולות מולקולריות מעל מגבלת ההדרה יוצאות מהעמודה בו זמנית. שברים קטנים מהעמודה נאספים בצינורות. כל שבר נבדק לאיכות מולקולת היעד על ידי אלקטרופורזה ג'ל או טכניקות אנליטיות אחרות.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
עכשיו בואו נסתכל על כרומטוגרפיה של זיקה או AC, אחת הדרכים היעילות ביותר לטהר חלבונים. ביומולקולים רבים נקשרים באופן סלקטיבי לנכסים מסוימים - A אשר AC משתמש בו על ידי דבקות בליגנד ספציפי למטרה לשלב הנייח.
כאשר התערובת זורמת דרך העמודה, מולקולות היעד מתחברות לליגנד, והשאר זורמות פנימה. לאחר שהתערובת עברה דרך הטור, ניתן לאסוף את מולקולת היעד באמצעות אחת משתי שיטות עילום המבוססות על ספציפיות.
האלה ביו-פיספית יכולה להיאמר שיש לה "תפקיד נורמלי" או "הפוך". בהתבררות ביו-פסיפית בעלת תפקיד רגיל, מתווסף סוכן שמתחרה בליגנד הדבוק כדי להיקשר לביומולקול היעד.
בהתבררות ביו-פיספית של תפקיד הפוך, סוכן מתחרה במטרה להיקשר לליגנד הדבוק. סוג ההחמקה השני, ההבהרה הלא-מינית , מוריד את איגוד היעד לליגנד על ידי שינוי ה- pH, הכוח היוני או הקוטביות של הפתרון. אם חלבון אינו נקשר לליגנד שניתן לשתק, ניתן לבטא את החלבון המכיל "תג": רצפי פפטיד קצרים שתוכננו להיקשר לליגנד.
מגוון אחד הוא כרומטוגרפיה של זיקת יון מתכת משותקת, "IMAC" בקיצור, שם ליגנד מתכת דבק, כמו ניקל או קובלט, נקשר לשאריות היסטידין על החלבון המותאם. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבוני היעד נוצרים עם שאריות היסטידין חוזרות, הנקראות תג פוליהיסטידין, הנקשר למתכת באמצעות שרשרת הצד של האימידזול על היסטידין. לאחר ההוגנה, ניתן לאסוף את החלבון עם imidazole חינם באמצעות elution ספציפי תפקיד הפוך ולאחר מכן משמש במגוון רחב של יישומים במורד הזרם. עכשיו שראיתם את התיאוריה של כרומטוגרפיה של זיקה, בואו נסתכל על הליך IMAC במעבדה.

</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
ב- IMAC, ניתן להוסיף את השלב הנייח ישירות לתערובת של שלב נייד מדגם, המאפשר את הכריכה של החלבון המתויג שלו. אז פסולת זו נשפכת לתוך הטור, שבו התרכובות שאינן קשורות מטפטפות לפסולת, בעוד הפסולת נשארת. מיכל תרחיף הוא שטף כדי לאסוף שאריות שרף ודגימה, אשר מתווסף לעמודה.
השרף מעורבב כדי להבטיח את הרכיבים הלא מאוגדים זורמים בחופשיות. מאגר כביסה נוסף מסייע לשטוף אותם. לאחר שכל הרכיבים הלא מאוגדים הוסרו, הפסולת מוחלפת במיכל לאיסוף חלבון היעד.
חוצץ המכיל imidazole מתווסף, מעורבב, ומותר לנוח כדי unbind מולקולת היעד. האימידזול נקשר למתכת, מחליף ומשחרר את החלבון המתויג. החלבון המשוחרר נאסף, וצעד האימידזול חוזר על עצמו כדי להבטיח איסוף כולל. כדי להמשיך לטהר את המדגם, ניתן להפעיל את SEC על המדגם לפני הניתוח.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
עכשיו שראינו את התיאוריה והנוהל של שתי הטכניקות האלה, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן הן מיושמות בתחום הביוכימי.
סיבה נפוצה לטהר חלבונים היא ללמוד את תפקידם במחלות. סיסטיק פיברוזיס נגרמת על ידי פגמים בחלבון הרגולטור מוליכות טרנסמברן סיסטיק פיברוזיס, או CFTR. לאחר גידול החלבון עם תג שלו בשמרים, הן זיקה והן כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מאפשרות בידוד של החלבון, ואחריו חקר תפקידו.
במקרים מסוימים, נוכחות של תג פוליהיסטידין יכול לשנות את המבנה של חלבון, ובכך להשפיע על תפקודו. תג נפוץ נוסף הוא חלבון מחייב מלטוז או MBP, אשר ייקשר עמילוז מאוגד בעמודה. לאחר מכן משמש מלטוז לשחרור המתחם. לאחר מכן ניתן לבקע את ה- MBP ולהסיר אותו עם SEC כדי לייצר את החלבון הרצוי הטהור.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_6">
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על מידה-הדרה וכרומטוגרפיה של זיקה. הוא כיסה את התיאוריה של הטכניקות, עבר על הליכים כלליים, וכיסה חלק מהשימושים בטכניקות.
תודה שצפיתם!
</div>

In biochemistry, chromatography-based purification methods are employed to isolate compounds from a complex mixture. Two such methods used commonly by ...

"כרומטוגרפיה" מתייחסת למגוון רחב של שיטות המשמשות לבידוד רכיב מתערובת מורכבת, שלב חיוני לפני שניתן לקבוע את התכונות והפעילויות של ביומולקולה. לכל טכניקה כרומטוגרפית יש מנגנון הפרדה שונה, בהתאם למטריצת הדגימה ולתרכובת המטרה. סרטון זה יתמקד בעקרונות ובפעולה של שתי שיטות הנפוצות בביוכימיה: אי הכללת גודל וכרומטוגרפיה של זיקה. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל או SEC מבוססת על גודל התרכובות בדגימה. שלב נייד המכיל את הדגימה מתווסף לעמודה עם חומר נקבובי: השלב הנייח. המולקולות בדגימה מתחלקות ל-1 מתוך 3 קטגוריות. מולקולות גדולות מכדי להיכנס לנקבוביות עוברות את המרחק הקצר ביותר דרך העמודה. כל מין עם משקל מולקולרי מעל "גבול ההרחקה" הזה ייצא מהעמודה באותו הזמן. מולקולות קטנות מספיק כדי להיכנס בחופשיות לנקבוביות יישמרו הכי הרבה זמן, וייצאו מהעמודה יחד. המשקל המולקולרי המאפשר כניסה מלאה של הנקבוביות הוא "גבול החלחול". רק מולקולות בין הגבולות הללו יופרדו זו מזו, מכיוון שהן מבלות פרקי זמן משתנים בפיזור לתוך הנקבוביות והחוצה מהן. מולקולות קטנות יותר נשמרות זמן רב יותר על העמודה מכיוון שהן מבלות זמן רב יותר בשלב הנייח, בעוד שמולקולות גדולות יותר בגבולות אלה יוצאות מוקדם יותר. משקלים מולקולריים על פני 1 עד 2 סדרי גודל נופלים בגבולות אלה. עמודות נבחרות מתוך מחשבה על כך, או שניתן להשתמש במספר עמודות בסדרה אם יש מגוון רחב של תרכובות רצויות. כעת, לאחר שראיתם את התיאוריה של ה-SEC, בואו נסתכל כיצד היא מתבצעת. כדי להתחיל בהליך ה-SEC, יש לאזן את העמודה עם מאגר מים וכרומטוגרפיה נטולי יונים. לאחר ההכנה, מאגר המכיל את הדגימה מוזרק לעמודה. לאחר מכן המאגר נדחף בקצב זרימה נמוך. גלאי עוקב אחר מה שיוצא מהעמודה כדי לקבוע את נוכחות האנליט הרצוי. מולקולות גדולות עם משקל מולקולרי מעל גבול ההרחקה יוצאות מהעמודה בו זמנית. שברים קטנים מהעמודה נאספים בצינורות. כל שבר נבדק לאיכות מולקולת המטרה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל או טכניקות אנליטיות אחרות. עכשיו בואו נסתכל על כרומטוגרפיה של זיקה או AC, אחת הדרכים היעילות ביותר לטיהור חלבונים. ביומולקולות רבות נקשרות באופן סלקטיבי לליגנדים מסוימים - תכונה ש-AC משתמשת בה על ידי הדבקת ליגנד ספציפי למטרה לשלב הנייח. כאשר התערובת זורמת דרך העמודה, מולקולות המטרה מתחברות לליגנד, והשאר זורמות דרכו. לאחר שהתערובת עברה דרך העמודה, ניתן לאסוף את מולקולת המטרה באחת משתי שיטות פליטה המבוססות על ספציפיות. ניתן לומר שלפליטה ביו-ספציפית יש תפקיד "נורמלי" או "הפוך". בפליטה ביו-ספציפית בתפקיד נורמלי, מתווסף חומר המתחרה בליגנד המודבק כדי להיקשר לביו-מולקולת המטרה. בפליטה ביו-ספציפית בתפקיד הפוך, סוכן מתחרה עם המטרה כדי להיקשר לליגנד המודבק. סוג הפליטה השני, "פליטה לא ספציפית", מוריד את קשירת המטרה לליגנד על ידי שינוי ה-pH, החוזק היוני או הקוטביות של התמיסה. אם חלבון אינו נקשר לליגנד שניתן לשתק, ניתן לבטא את החלבון המכיל "תג": רצפי פפטידים קצרים המהונדסים להיקשר לליגנד. זן אחד הוא כרומטוגרפיה של זיקה ליוני מתכת משותקת, "IMAC" בקיצור, שבה ליגנד מתכת דבוק, כמו ניקל או קובלט, נקשר לשאריות היסטידין על החלבון המותאם. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבוני מטרה נוצרים עם שאריות היסטידין חוזרות, הנקראות תג פוליהיסטידין, הנקשר למתכת דרך שרשרת הצד של האימידזול על היסטידין. לאחר קשירה, ניתן לאסוף את החלבון עם אימידזול חופשי באמצעות פליטה ספציפית בתפקיד הפוך ומאוחר יותר להשתמש בו במגוון רחב של יישומים במורד הזרם.? כעת, לאחר שראיתם את התיאוריה של כרומטוגרפיה של זיקה, בואו נסתכל על הליך IMAC במעבדה. ב-IMAC, ניתן להוסיף את השלב הנייח ישירות לתערובת של השלב הנייד והדגימה, מה שמאפשר את קשירת החלבון המתויג שלו. לאחר מכן יוצקים את התרחיץ הזה לתוך העמוד, שם התרכובות הלא קשורות מטפטפות לפסולת, בעוד התרחיץ נשאר. מיכל התרחיץ נשטף כדי לאסוף שאריות שרף ודגימה, המתווספים לעמודה. מערבבים את השרף כדי להבטיח שהרכיבים הלא קשורים זורמים בחופשיות. תוספת חוצץ כביסה עוזרת לשטוף אותם. לאחר הסרת כל הרכיבים הלא קשורים, הפסולת מוחלפת במיכל לאיסוף חלבון המטרה. מאגר המכיל אימידזול מתווסף, מערבב ונותן לו לנוח כדי לשחרר את מולקולת המטרה. האימידזול נקשר למתכת, מחליף ומשחרר את החלבון המתויג. החלבון המשוחרר נאסף, ושלב האימידזול חוזר על עצמו כדי להבטיח איסוף מלא. כדי לטהר עוד יותר את הדגימה, ניתן להפעיל SEC על הדגימה לפני הניתוח. כעת, לאחר שראינו את התיאוריה וההליך של שתי הטכניקות הללו, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן הן מיושמות בתחום הביוכימי. סיבה נפוצה לטיהור חלבונים היא לחקור את תפקידם במחלות. סיסטיק פיברוזיס נגרמת על ידי פגמים בחלבון מווסת המוליכות הטרנסממברנית של סיסטיק פיברוזיס, או CFTR. לאחר גידול החלבון עם תג שלו בשמרים, גם כרומטוגרפיה של זיקה וגם כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מאפשרות בידוד של החלבון, ואחריו חקר תפקודו. במקרים מסוימים, נוכחות של תג פוליהיסטידין יכולה לשנות את מבנה החלבון, ובכך להשפיע על תפקודו. תג נפוץ נוסף הוא חלבון קושר מלטוז או MBP, שייקשר לעמילוז קשור בעמודה. לאחר מכן משתמשים במלטוז כדי לשחרר את הקומפלקס. לאחר מכן ניתן לבקע את ה-MBP ולהסיר אותו עם SEC כדי לייצר את החלבון הטהור הרצוי. זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על אי הכללת גודל וכרומטוגרפיה של זיקה. הוא כיסה את התיאוריה של הטכניקות, עבר על נהלים כלליים וכיסה חלק מהשימושים של הטכניקות. תודה שצפית!

Education

JoVE Science Education

Chemistry

כימיה

Biochemistry

ביוכימיה

protein purification with sec and imac

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC.

Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A sample moves through a column packed with porous beads, which make up the stationary phase. Large molecules that cannot enter the pores travel the shortest path and leave first. Smaller molecules enter the pores, spend more time in the column, and leave later. Molecules between the exclusion limit and the permeation limit can be separated from each other, while molecules above or below those limits exit together.

The SEC procedure begins with equilibration of the column using deionized water and chromatography buffer. Sample-containing buffer is then injected, and the liquid is pushed through at a low flow rate. A detector watches what comes out of the column, and fractions are collected in tubes. These fractions can then be checked for the target molecule by gel electrophoresis or other analytical methods.

Affinity chromatography, or AC, uses the fact that many biomolecules bind selectively to certain ligands. In this method, a target-specific ligand is attached to the stationary phase. As the mixture passes through the column, the target binds to the ligand while the rest flows through. The target can then be released by biospecific elution, which may use a competing agent in normal-role or reverse-role form, or by nonspecific elution, which changes pH, ionic strength, or polarity.

If a protein does not naturally bind to an immobilized ligand, it can be engineered with a tag. A common example is a polyhistidine tag, or his-tag. In immobilized metal ion affinity chromatography, nickel or cobalt on the column binds to histidine residues through the imidazole side chain. The tagged protein is then released with free imidazole by reverse-role specific elution and can be used in downstream applications.

The IMAC procedure begins by mixing the stationary phase with the sample so the his-tagged protein can bind. The slurry is poured into the column, and unbound material drains to waste. The resin is rinsed into the column, stirred, and washed to remove leftover unbound components. After that, a container is placed to collect the target protein, and imidazole buffer is added to release it. The imidazole binds the metal, displaces the tagged protein, and the collected step may be repeated to improve recovery. For further cleanup, SEC can be run before analysis.

These purification methods are useful in biochemical and biomedical research. One example is cystic fibrosis research, where the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR, is grown with a his-tag in yeast and then isolated with affinity and size-exclusion chromatography. In some cases, a polyhistidine tag can change protein structure and affect function. Another tag used in protein work is maltose-binding protein, or MBP, which binds amylose in a column and is released with maltose. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the desired pure protein.

Protein Purification with SEC and IMAC

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

This collection presents commonly used purification methods, such as affinity chromatography, as well as analytical methods, like MALDI-TOF. In addition, the videos showcase methods for assessing biomolecule interaction and function, such as co-immunoprecipitation and metabolic labeling.

Explore how size-exclusion chromatography and IMAC separate proteins by size or binding, and see how tagged proteins are purified for research.

Protein Purification with SEC and IMAC | JoVE K12

Overview

Size-Exclusion Chromatography

Operation of Size-Exclusion Chromatography

Affinity Chromatography

Operation of Affinity Chromatography

Applications

Summary

What is Photosynthesis?

Photosynthesis is a multipart, biochemical process that occurs in plants as well as in some bacteria. It captures carbon dioxide and solar energy to ...

Light as Energy

The energy required to carry out photosynthesis is light&#8212; typically electromagnetic radiation from the sun. The range of all possible wavelengths is ...

Anatomy of Chloroplasts

Green algae and plants, including green stems and unripe fruit, harbor chloroplasts&mdash;the vital organelles where photosynthesis takes place. In ...

Photosystem II

The multi-protein complex photosystem II (PS II) harvests photons and transfers their energy through its bound pigments to its reaction center, and ...

Photosystem I

Although structurally similar to photosystem II (PSII), photosystem I (PSI) is has a different electron supplier and electron acceptor.
Both these ...

The Calvin Cycle

Overview

Oxygenic photosynthesis converts approximately 200 billion tons of carbon dioxide (CO2) annually to organic compounds and produces approximately ...

C4 Pathway and CAM

Most plants use the C3 pathway for carbon fixation. However, some plants, such as sugar cane, corn, and cacti that grow in hot conditions, use alternative ...

the-z-scheme-of-electron-transport-in-photosynthesis

The Z-Scheme of Electron Transport in Photosynthesis

The light reactions of photosynthesis assume a linear flow of electrons from water to NADP+. During this process, light energy drives the splitting of ...

Photosynthesis

Autotrophs

Almost all living organisms on Earth depend on photosynthesis, which is the process that converts sunlight energy into a simple sugar called ...

Plant Pigment Chromatography and Floating Leaf Discs in a Vacuum
ExpandOn the day before the experiment, fill a container with water.
Place the spinach ...

Plant Pigment Chromatography
ExpandNOTE: In this experiment you will separate pigments from spinach leaves using chromatography paper. Individual pigments ...

First Law of Thermodynamics

The First Law of Thermodynamics states that energy cannot be created or destroyed, only transformed. This can be demonstrated within a classic food web ...

Photosystems

Photosystems are multiprotein complexes that form the functional units of photosynthesis in plants, algae, and cyanobacteria. They are found embedded in ...

An Introduction to Cell Metabolism

In cells, critical molecules are either built by joining together individual units like amino acids or nucleotides, or broken down into smaller ...

Reconstitution of Membrane Proteins

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

Use a model to illustrate how photosynthesis transforms light energy into stored chemical energy.

HS-LS1-5.

Macromolecules

Biomolecules
Organisms contain a wide variety of organic molecules with numerous functions which depend on the chemical structures and properties of these ...

Solution Preparation
ExpandCAUTION: It is important to always use care when handling reagents. For example, iodine will stain clothes and skin so wear ...

Identifying Macromolecules with Indicator Solutions
ExpandHYPOTHESES: In this activity, the experimental hypothesis might be that the addition of an ...

Introduction to Carbohydrates

Carbohydrates, proteins, and fats are the primary macronutrients in the human diet. However, carbohydrates are the most favored source of energy in the ...

Carbohydrate Metabolism

Sugars as Energy Storage Molecules

Chemistry of Carbohydrates

Carbohydrates are an essential part of the diet in humans and animals. Grains, fruits, and vegetables are natural sources of carbohydrates that provide ...

Oligosaccharide Assembly

Protein glycosylation starts in the ER lumen and continues in the Golgi apparatus. Glycosyltransferases catalyze the addition of sugar molecules or ...

What are Lipids?

lipid-derived-compounds-in-the-human-body

Lipid-derived Compounds in the Human Body

Fats and lipids are crucial components in the human body. Some lipid-derived compounds, such as fat-soluble vitamins, eicosanoids, lipoproteins, and ...

Fats as Energy Storage Molecules

Structure of Lipids

Lipids include a diverse group of compounds that are largely nonpolar in nature. This is because they are hydrocarbons that include mostly nonpolar ...

Proteins and Amino Acids

Overview

Proteins are chains of amino acids that are connected by peptide bonds and folded into a 3-dimensional structure. The side chains of individual ...

Amino acids

Amino acids are the monomers that comprise proteins. Each amino acid has the same fundamental structure, which consists of a central carbon atom, or the ...

Peptide Bonds

A peptide bond covalently attaches amino acids through a dehydration reaction. One amino acid&#39;s carboxyl group and another amino acid&#39;s amino ...

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

Conditions on Early Earth

Around 4 billion years ago, oceans began to condense on earth while volcanic eruptions released nitrogen, carbon dioxide, methane, ammonia, and hydrogen ...

ATP and Macromolecule Synthesis

Biological macromolecules are organic compounds, predominantly composed of carbon atoms. The carbon atoms are covalently bonded with hydrogen, oxygen, ...

Dietary Connections

In biological systems, most metabolic pathways are interconnected. The cellular respiration processes that convert glucose to ATP&#8212;such as ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

Overview of Nitrogen Metabolism

Nitrogen is a very important element for life because it is a major constituent of proteins and nucleic acids. It is a macronutrient, and in nature, it is ...

Compounds Essential to Human Function

The human body is composed of cells that are fundamentally made up of several different molecules. These molecules are essential to carry out all ...

an-introduction-to-molecular-developmental-biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

Molecular signals play a major role in the complex processes occurring during embryonic development. These signals regulate activities such as cell ...

Dehydration Synthesis

Dehydration synthesis (also called a condensation reaction) is the chemical process in which two molecules covalently link together to form a new ...

an-introduction-to-saccharomyces-cerevisiae

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

All living organisms on Earth are directly or indirectly dependent on photosynthesis. It is the only biological process that can capture energy from ...

an-overview-of-alkenone-biomarker-analysis-for-paleothermometry

An Overview of Alkenone Biomarker Analysis for Paleothermometry

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
Throughout this series of videos, natural samples were extracted and ...

an-introduction-to-caenorhabditis-elegans

An Introduction to Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a microscopic, soil-dwelling roundworm that has been powerfully used as a model organism since the early 1970&rsquo;s.  It was ...

An Overview of Epigenetics

Since the early days of genetics research, scientists have noted certain heritable phenotypic differences that are not due to differences in the ...

An Introduction to Cell Death

Necrosis, apoptosis, and autophagic cell death are all manners in which cells can die, and these mechanisms can be induced by different stimuli, such as ...

An Overview of Gene Expression

Gene expression is the complex process where a cell uses its genetic information to make functional products. This process is regulated at multiple ...

An Introduction to Cell Division

Cell division is the process by which a parent cell divides and gives rise to two or more daughter cells. It is a means of reproduction for single-cell ...

An Overview of Genetic Analysis

An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

an-introduction-to-cell-motility-and-migration

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

an-introduction-to-cellular-and-molecular-neuroscience

An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, ...

An Overview of Genetics and Disease

Many human diseases are associated with mutations or variations in genetic sequences. Some of these genetic variants are heritable, passed down from ...

an-introduction-to-developmental-genetics

An Introduction to Developmental Genetics

Development is the complex process through which a single-celled embryo transforms into a multicellular organism. Developmental processes are guided by ...

an-overview-of-bgdgt-biomarker-analysis-for-paleoclimatology

An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

Annexin V and Propidium Iodide Labeling

Staining with annexin V and propidium iodide (PI) provides researchers with a way to identify different types of cell death&#8212;either necrosis or ...

Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

Construct and revise an explanation based on evidence for how carbon, hydrogen, and oxygen from sugar molecules may combine with other elements such as nitrogen, sulfur, and phosphorus to form amino acids and other carbon-based molecules.

Protein Purification with SEC and IMAC

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards