Name: protein interaction capture methods in cells
Uploaded: 2023-04-30T06:31:42.000Z
Duration: 8 min 8 s
Channel: JoVE

K12 Standards

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

High School

Physical Science

HS. Chemical Reactions

HS-PS1-5.

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

אימונופרציפיטציה משותפת (CoIP) ובוחות ישבן מושכות למטה הן שיטות קשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות יציבות בין חלבון חלבון. שיטות אלה קשורות אימונופרפיציטציה, שיטה להפרדת חלבון יעד הקשור לנוגדן מחלבונים לא מאוגדים. ב- CoIP, חלבון הקשור לנוגדנים קשור בעצמו לחלבון אחר שאינו נקשר לנוגדן, ואחריו תהליך הפרדה המשמר את קומפלקס חלבון החלבון. ההבדל בבחינת מטה הוא שחלבוני פיתיון מתויגים זיקה מחליפים נוגדנים, וכרומטוגרפיה של זיקה משמשת לבידוד תסביבי חלבון חלבון.
וידאו זה מסביר CoIP, משיכה למטה assays, ואת היישום שלהם במעבדה. פרוטוקול שלב אחר שלב עבור כל טכניקה מכוסה, כולל ריאגנטים, מכשירים ומכשירים המשמשים לטיהור וניתוח חלבונים קשורים. בנוסף, סעיף היישומים של וידאו זה מתאר הליך כדי לחקור כיצד חלבונים myxovirus לעכב נוקלאופרוטאין שפעת, חקירה לתוך התפקיד של יוני סידן ב calmodulin באמצעות בדיקה למטה, ובדיקה מושכת למטה שונה לאפיון אינטראקציות חלבון חולף.

שיתוף פעולה עם אימונופרפיטציה וביטולי נסיגה

אימונופרציפיטציה משותפת (CoIP) ובוחות ישבן מושכות למטה הן שיטות קשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות יציבות בין חלבון חלבון. שיטות אלה קשורות אימונופרפיציטציה, שיטה להפרדת חלבון יעד הקשור לנוגדן מחלבונים לא מאוגדים. ב- CoIP, חלבון הקשור לנוגדנים קשור בעצמו לחלבון אחר שאינו נקשר לנוגדן, ואחריו תהליך הפרדה המשמר את קומפלקס חלבון החלבון. ההבדל בבחינת מטה הוא שחלבוני פיתיון מתויגים זיקה מחליפים נוגדנים, וכרומטוגרפיה של זיקה משמשת לבידוד תסביבי חלבון חלבון.
וידאו זה מסביר CoIP, משיכה למטה assays, ואת היישום שלהם במעבדה. פרוטוקול שלב אחר שלב עבור כל טכניקה מכוסה, כולל ריאגנטים, מכשירים ומכשירים המשמשים לטיהור וניתוח חלבונים קשורים. בנוסף, סעיף היישומים של וידאו זה מתאר הליך כדי לחקור כיצד חלבונים myxovirus לעכב נוקלאופרוטאין שפעת, חקירה לתוך התפקיד של יוני סידן ב calmodulin באמצעות בדיקה למטה, ובדיקה מושכת למטה שונה לאפיון אינטראקציות חלבון חולף.
<div class="chapter_text" id="script_0">
אינטראקציות חלבון-חלבון לשחק תפקיד משמעותי במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. רוב האינטראקציות בין חלבון לחלבון והשפעותיהם הביולוגיות טרם זוהו. שיתוף אימונופרציפיטציה, או CoIP, וביטולים מושכים למטה הן שתי שיטות הקשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון יציבות. וידאו זה יכסה את העקרונות של שני מבאי, נהלי המעבדה הכלליים שלהם, ויישומים של טכניקות אלה.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
CoIP ובדיקות מושכות למטה הן גרסאות של אימונופרציפיטציה, שיטה לבידוד סלקטיבי של מיני חלבון מתמיסה מורכבת. בניסוי אימונופרציפיטציה, נוגדן ספציפי לחלבון מטרה רשאי ליצור קומפלקס חיסוני עם מטרה זו במדגם. לאחר מכן, המתחם נלכד על תמיכה מוצקה, בדרך כלל חלבון A קשור חרוז ספרוז. כל החלבונים שלא נלכדו מוסרים על ידי שלבי צנטריפוגה. לאחר מכן החלבון משתחרר מהנוגדנים והתמיכה המוצקה על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת הדגימה של SDS-PAGE.
אימונופרציפיטציה משותפת מתבצעת באותו אופן, אלא שתומכי חלבון שלמים נלכדים על התמיכה המוצקה. הנוגדן נקשר לחלבון היעד, אשר, בתורו, קשור לחלבון אחר שאינו ממוקד על ידי הנוגדן. כמו אימונופרציפיטציה, קומפלקס החלבון משתחרר מהנוגדנים ותמיכה מוצקה על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת דגימת SDS-PAGE.
בדיקות משוך כלפי מטה דומות ל-co-immunoprecipitation, שונות רק בשימוש בחלבון "פיתיון", בניגוד לנוגדן. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבון פיתיון זה מהונדס עם תג זיקה, כגון סדרה של שאריות היסטידין. תגי זיקה אלה מתוארים ב"הפרדות ביומולקוליות מבוססות כרומטוגרפיה". לאחר מכן החלבון נלכד על ליגנד זיקה משותק ספציפי לתג. לאחר מכן דגירה החלבון שנתפס עם מדגם המכיל חלבונים היוצרים קומפלקסים עם "הפיתיון". קומפלקס החלבון משתחרר מתמיכת הזיקה על ידי כביסה עם פתרון המכיל ניתוח תחרותי ספציפי לתג על חלבון "הפיתיון". גישרושים שימושיים לאישור אינטראקציות חלבון שנחזו על ידי אימונופרציפיטציה משותפת, ולגילוי אינטראקציות חלבון לא ידועות.
עכשיו, לאחר שנדונו העקרונות של אימונופרפיטציה משותפת ובדיחות נסיגה, בואו נסתכל על נהלי המעבדה שלהם.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
ראשית, בואו נדבר על אימונופרציפיטציה משותפת. לסדרה של צינורות מיקרו-פוגה מתווספים: חוצץ PBS, ופתרון של 50% חלבון A-ספרוז, קומפלקס חלבון שרף שנקשר לנוגדן. צינורות המיקרו-פוגה מסובבים כדי להבטיח הפצה נכונה, ואז השרף נשטף עם חוצץ PBS נוסף. ליסאט התא, המכיל את החלבון הרצוי, ו 2 מיקרוגרם של נוגדן מתווספים צינורות microfuge, ואת התערובת מסובבת במשך 1 שעות ב 4 °C (70 °F). החרוזים מגולפים על ידי צנטריפוגה, הסופר-נט מושלך, והחרוזים נשטפו מחדש שלוש פעמים עם חוצץ כדי להסיר חלבון שאינו קשור. החרוזים המכילים את קומפלקס הנוגדנים-חלבון נמצאים בהפחתת מאגר טעינת הדגימה SDS-PAGE, להסרת המתחם מהנוגדן ולניתוח על ידי SDS-PAGE וחיסון.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
עכשיו נדון בהליך לבדיקות משוך למטה: חלבון "הפיתיון" בא לידי ביטוי בפלסטיד עם תג הזיקה המתאים. לאחר הגעה לצמיחה בשלב יומן הרישום, התאים הם lysed, ולאחר מכן צנטריפוגה. חרוזי סטרפטווידין-ספרוז מושעים, הלוכדים חלבון "פיתיון" מתויג ביוטין, מועברים לצינור מיקרו-פאג'. לאחר מכן החרוזים הם צנטריפוגות ואת supernatant הוסר בזהירות על ידי שאיפה. לאחר מכן, החרוזים נשטפים עם חוצץ, צנטריפוגה, ואת supernatant הוסר.
תאים המכילים את חלבון "הטרף" putative, אשר יש זיקה לחלבון "פיתיון", נקצרים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, הסופר-נט מתווסף לצינור המיקרו-פוגה המכיל את השרף, ודורג ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות על שייקר. לאחר מכן, השרף הוא צנטריפוגה, הסופר-טבעי הוסר, והשרף נשטף כדי להסיר חלבון שאינו קשור. חוצץ Elution מתווסף שרף, ואת התערובת הוא דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות על שייקר. לאחר מכן, השרף הוא צנטריפוגה, ואת supernatant המכיל את המתחם הרצוי מנותח על ידי אימונובלוטלינג.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
עכשיו שבדקנו את הנהלים, בואו נסתכל על כמה מהיישומים השימושיים של אימונופרנציה משותפת ובדיקות נסיגה.
שיתוף immunoprecipitation יכול להיות שימושי בהבנה טובה יותר של מנגנון הפעולה של אנזימים. Myxovirus-, או Mx-, חלבוני התנגדות לעכב מגוון רחב של וירוסים, כולל שפעת A, אשר המנגנון הוא מובן היטב. Co-immunoprecipitation שימש כדי ללמוד את האינטראקציה בין חלבון Mx1 העכבר ונוקלאופרוטאין שפעת.
בדיקות משוך למטה הוכיחו שימושי בחקר ההשפעות של שליחים שניים, שהם חלבונים המתקשרים אות מהסביבה התאית. הם מרכיב של מסלול איתות שבו חלבונים מרובים אינטראקציה בתגובה רמזים סביבתיים. יוני סידן פועלים כשליחים משניים על ידי קשירה ל- calmodulin, אשר, בתורו, נקשר למגוון רחב של חלבונים, בתיווך סוגים רבים של תגובות ביולוגיות. בלי הסידן, החלבון לא יכול להיקשר לקלמולין. בדיקה משוך למטה נערך כדי לבדוק את היכולת של חלבונים להיקשר calmodulin בנוכחות או היעדר יוני סידן.
שיתוף אימונופרציפיטציה וביטולים נמשכים משמשים בדרך כלל לניתוח אינטראקציות חלבון יציבות או חזקות, אך לא חולפות. התפתחות אחרונה בהתקפות מושכות למטה, HaloTag, פישטה את המחקר של אינטראקציות חלבון חולפות; HaloTag הוא תג היתוך חלבון מקודד גנטית, מותך לחלבון בעל עניין, המסוגל להגיב כימית עם תמיכה מוצקה haloalkane. אם נדרש ניתוח פונקציונלי, קומפלקס החלבון, מינוס התג, בשלמותו יכול להיות מבודד על ידי דגירה עם פרוטאז וירוס חרט חרטה טבק.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אימונופרפיטציה משותפת ובבדיקים מושכים למטה. סרטון זה תיאר את עקרונות שתי השיטות, את נהלי המעבדה הכלליים וחלק מהיישומים שלהם.
תודה שצפיתם!
</div>

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related ...

אינטראקציות חלבון-חלבון ממלאות תפקיד משמעותי במגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. רוב האינטראקציות בין חלבון לחלבון וההשפעות הביולוגיות שלהן טרם זוהו. Co-immunoprecipitation, או CoIP, ובדיקות נפתחות הן שתי שיטות קשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון יציבות. סרטון זה יכסה את העקרונות של שתי הבדיקות, נהלי המעבדה הכלליים שלהן ויישומים של טכניקות אלה. CoIP ובדיקות נפתחות הן גרסאות של משקעים חיסוניים, שיטה לבידוד סלקטיבי של מין חלבון מתמיסה מורכבת. בניסוי אימונו-משקעים, נוגדן ספציפי לחלבון מטרה מורשה ליצור קומפלקס חיסוני עם המטרה הזו בדגימה. לאחר מכן הקומפלקס נלכד על תומך מוצק, בדרך כלל חלבון A הקשור לחרוז ספרוז. כל החלבונים שלא נלכדו מוסרים על ידי שלבי צנטריפוגה. לאחר מכן החלבון משתחרר מהנוגדן ומהתמיכה המוצקה על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת הדגימה של SDS-PAGE. קו-אימונו-משקעים מבוצעים באותו אופן, אלא שמתחמי חלבון שלמים נלכדים על התמיכה המוצקה. הנוגדן נקשר לחלבון המטרה, אשר, בתורו, קשור לחלבון אחר שאינו ממוקד על ידי הנוגדן. כמו במשקעים חיסוניים, קומפלקס החלבון משתחרר מהנוגדן ותומך במוצק על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת דגימת SDS-PAGE. מבחנים נפתחים דומים לקו-אימונו-משקעים, ונבדלים רק בשימוש בחלבון "פיתיון", בניגוד לנוגדן. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבון פיתיון זה מהונדס עם תג זיקה, כגון סדרה של שאריות היסטידין. תגי זיקה אלה מתוארים ב"הפרדות ביומולקולות מבוססות כרומטוגרפיה". לאחר מכן החלבון נלכד על ליגנד זיקה משותק ספציפי לתג. לאחר מכן החלבון שנלכד מודגר עם דגימה המכילה חלבונים היוצרים קומפלקסים עם ה"פיתיון". קומפלקס החלבון משתחרר מתמיכת הזיקה על ידי שטיפה בתמיסה המכילה אנליט תחרותי ספציפי לתג על חלבון ה"פיתיון". מבחנים נפתחים שימושיים לאישור אינטראקציות חלבון הצפויות על ידי קו-אימונו-משקעים, ולגילוי אינטראקציות חלבון לא ידועות. כעת, לאחר שנדונו העקרונות של קו-אימונו-משקעים ומבחנים נפתחים, בואו נסתכל על נהלי המעבדה שלהם. ראשית בואו נדון בקו-אימונו-משקעים. לסדרה של צינורות מיקרופוגה מתווספים הדברים הבאים: מאגר PBS, ותמיסה של 50% של חלבון A-sepharose, קומפלקס שרף-חלבון שנקשר לנוגדן. צינורות המיקרופוגה מסובבים כדי להבטיח פיזור תקין, ולאחר מכן השרף נשטף עם מאגר PBS נוסף. ליזאט תאים, המכיל את החלבון הרצוי, ו-2 גרם נוגדנים מתווספים לצינורות המיקרופוגה, והתערובת מסובבת למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס. החרוזים מגולגלים על ידי צנטריפוגה, הסופרנטנט מושלך והחרוזים נשטפים מחדש שלוש פעמים עם בופר כדי להסיר חלבון לא קשור. החרוזים המכילים את קומפלקס הנוגדן-חלבון נמצאים בהפחתת מאגר טעינת הדגימה של SDS-PAGE, להסרת הקומפלקס מהנוגדן ולניתוח על ידי SDS-PAGE ו-immunoblotting. כעת נדון בהליך לבדיקות נשלפות: חלבון ה"פיתיון" מתבטא בפלסמיד עם תג הזיקה המתאים. לאחר שהגיעו לצמיחה בשלב העץ, התאים עוברים ליזה ולאחר מכן צנטריפוגה. חרוזי סטרפטווידין-ספרוז תלויים, הלוכדים חלבון "פיתיון" מתויג ביוטין, מוזרמים לתוך צינור מיקרופוגה. לאחר מכן החרוזים עוברים צנטריפוגה והסופרנטנט מוסר בזהירות על ידי שאיפה. לאחר מכן שוטפים את החרוזים עם חיץ, צנטריפוגה ומסירים את הסופרנטנט. תאים המכילים את חלבון ה"טרף" המשוער, שיש לו זיקה לחלבון ה"פיתיון", נקצרים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן מוסיפים את הסופרנטנט לצינור המיקרופוגה המכיל את השרף, ומודגרים ב-4 ? C למשך 3 שעות על שייקר. לאחר מכן השרף עובר צנטריפוגה, הסופרנטנט מוסר והשרף נשטף כדי להסיר חלבון שאינו קשור. מאגר אלוטיון מתווסף לשרף, והתערובת מודגרת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר. לאחר מכן השרף עובר צנטריפוגה, והסופרנטנט המכיל את הקומפלקס הרצוי מנותח על ידי אימונובלוטינג. כעת, לאחר שסקרנו את הנהלים, בואו נסתכל על כמה מהיישומים השימושיים של משקעים חיסוניים ובדיקות נפתחות. קו-אימונו-משקעים יכולים להיות שימושיים בהבנה טובה יותר של מנגנון הפעולה של אנזימים. חלבוני עמידות ל-Myxovirus, או Mx-, מעכבים מגוון רחב של נגיפים, כולל שפעת A, שעבורם המנגנון אינו מובן היטב. קו-אימונו-משקעים שימשו לחקר האינטראקציה בין חלבון Mx1 של עכבר לנוקלאופרוטאין שפעת. מבחנים נפתחים הוכחו כשימושיים בחקר ההשפעות של שליחים שניים, שהם חלבונים המתקשרים אות מהסביבה התאית. הם מרכיב במסלול איתות שבו חלבונים מרובים מתקשרים בתגובה לרמזים סביבתיים. יוני סידן פועלים כשליחים משניים על ידי קשירה לקלמודולין, אשר, בתורו, נקשר למגוון רחב של חלבונים, ומתווך סוגים רבים של תגובות ביולוגיות. ללא הסידן, החלבון לא יכול להיקשר לקלמודולין. נערכה בדיקה נפתחת כדי לבדוק את יכולתם של חלבונים להיקשר לקלמודולין בנוכחות או בהיעדר יוני סידן. מבחני קו-אימונו-משקעים ומבחני משיכה משמשים בדרך כלל לניתוח אינטראקציות חלבון יציבות או חזקות, אך לא חולפות. התפתחות אחרונה במבחנים נפתחים, HaloTag, פשטה את המחקר של אינטראקציות חלבון חולפות; HaloTag הוא תג היתוך חלבונים מקודד גנטית, המותך לחלבון המבוקש, המסוגל להגיב כימית עם תמיכה מוצקה של הלואלקן. אם רוצים ניתוח פונקציונלי, ניתן לבודד את קומפלקס החלבון, מינוס התג, בשלמותו על ידי דגירה עם פרוטאז של נגיף תחריט הטבק. זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על משקעים חיסוניים משותפים ומבחנים נפתחים. סרטון זה תיאר את העקרונות של שתי השיטות, את נהלי המעבדה הכלליים וחלק מהיישומים שלהם. תודה שצפית!

Education

JoVE Science Education

Chemistry

כימיה

Biochemistry

ביוכימיה

protein interaction capture methods in cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody.

In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the antibody does not recognize. The intact protein complex is collected on a solid support, such as protein A on sepharose beads, so the interaction is preserved during separation. In pull-down assays, the bait protein is tagged instead of using an antibody. The tagged bait is captured by affinity chromatography and used to isolate the proteins that bind to it.

The CoIP procedure begins with PBS buffer and protein A-sepharose in microfuge tubes. The tubes are rotated, washed, and then mixed with cell lysate and about 2 micrograms of antibody. After 1 hour at 4 degrees Celsius, the beads are centrifuged, washed three times, and placed in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer. The released proteins are then analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting.

The pull-down procedure uses a bait protein expressed with an affinity tag, such as a series of histidine residues or a biotin tag. After the cells reach log-phase growth, they are lysed and centrifuged. Streptavidin-sepharose beads can capture the biotin-tagged bait, and the beads are then washed before the putative prey protein is added. The mixture is incubated at 4 degrees Celsius for 3 hours on a shaker, washed again, and eluted with buffer. The final complex is analyzed by immunoblotting.

These methods are useful for confirming predicted protein interactions and for finding unknown ones. CoIP has been used to study how mouse Mx1 protein interacts with influenza nucleoprotein, which helps explain the action of myxovirus resistance proteins against influenza A. Pull-down assays have also been used to test how calcium ions affect calmodulin binding, since calmodulin binds many proteins only when calcium is present. For transient protein interactions, a modified pull-down approach using HaloTag can help, and tobacco etch virus protease can remove the tag if functional analysis is needed.

Protein Interaction Capture Methods in Cells

protein-interaction-capture-methods-in-cells

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

This collection presents commonly used purification methods, such as affinity chromatography, as well as analytical methods, like MALDI-TOF. In addition, the videos showcase methods for assessing biomolecule interaction and function, such as co-immunoprecipitation and metabolic labeling.

Learn how CoIP and pull-down assays capture protein-protein interactions, from bead-based lab steps to examples with influenza proteins and calmodulin.

Protein Interaction Capture Methods in Cells | JoVE K12

Life Science

Structure and Function

HS-LS1-2.

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Overview

Principles of Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

Protocol for Co-Immunoprecipitation

Protocol for Pull-Down Assays

Applications

Summary

The Periodic Table

As early chemists discovered more elements, they realized that various elements could be grouped by their similar chemical behaviors. One such grouping ...

Alkali Metals

Group 1 elements are soft and shiny metallic solids. They are malleable, ductile, and good conductors of heat and electricity. The melting points of the ...

Halogens

Group 17 elements, known as halogens, are nonmetals. At room temperature, fluorine and chlorine are gases, bromine is a liquid, and iodine a solid. ...

Noble Gases


The elements in group 18 are noble gases (helium, neon, argon, krypton, xenon, and radon). They earned the name &ldquo;noble&rdquo; because they were ...

Classifying Matter by State

Chemistry is the study of matter and the changes it undergoes. Matter is anything that has mass and occupies space. Matter is all around us; the air, ...

Classifying Matter by Composition

Matter: Pure Substances and Mixtures
According to its composition, the matter can be classified into two broad categories &mdash; pure substances and ...

physical-and-chemical-properties-of-matter

Physical and Chemical Properties of Matter

The characteristics that enable us to distinguish one substance from another are called properties.

Physical Properties of Matter

A physical property is ...

Types of Chemical Bonds

Chemical bonding theories were pioneered by American chemist Gilbert&#xA0;N. Lewis. He developed a model called the Lewis model to explain the type and ...

Lewis Symbols and the Octet Rule

Chemical bonds are complex interactions between two or more atoms or ions, which reduce the potential energy of the molecule. Gilbert N. Lewis developed a ...

Ionic Bonding and Electron Transfer

Ions are atoms or molecules bearing an electrical charge. A cation (a positive ion) forms when a neutral atom loses one or more electrons from its valence ...

The Born-Haber Cycle

Lattice Energy&#xA0;

An ionic compound is stable because of the electrostatic attraction between its positive and negative ions. The lattice energy of a ...

trends-in-lattice-energy-ion-size-and-charge

Trends in Lattice Energy: Ion Size and Charge

An ionic compound is stable because of the electrostatic attraction between its positive and negative ions. The lattice energy of a compound is a measure ...

Covalent Bonding and Lewis Structures

Compared to ionic bonds, which results from the transfer of electrons between metallic and nonmetallic atoms, covalent bonds result from the mutual ...

Electronegativity

Whether a bond is nonpolar or polar covalent is determined by a property of the bonding atoms called electronegativity.&#xA0;

Electronegativity values of ...

Ionization Energy

The amount of energy required to remove the most loosely bound electron from a gaseous atom in its ground state is called its first ionization energy ...

bond-polarity-dipole-moment-and-percent-ionic-character

Bond Polarity, Dipole Moment, and Percent Ionic Character

Bond Polarity

The absolute value of the difference in electronegativity (&Delta;EN) of two bonded atoms provides a rough measure of the polarity to be ...

Electron Affinity

The electron affinity (EA) is the energy change for adding an electron to a gaseous atom to form an anion (negative ion).



This process can be either ...

lewis-structures-of-molecular-compounds-and-polyatomic-ions

Lewis Structures of Molecular Compounds and Polyatomic Ions

To draw Lewis structures for complicated molecules and molecular ions, it is helpful to follow a step-by-step procedure as outlined:


	Determine the ...

assembly-of-a-reflux-system-for-heated-chemical-reactions

Assembly of a Reflux System for Heated Chemical Reactions

Source: Laboratory of Dr. Philip Miller &#8212; Imperial College London
Many chemical experiments require elevated temperatures before any reaction is ...

Resonance

The Lewis structure of a nitrite anion (NO2&minus;) may actually be drawn in two different ways, distinguished by the locations of the N-O and N=O ...

conducting-reactions-below-room-temperature

Conducting Reactions Below Room Temperature

Source: Laboratory of Dr. Dana Lashley - College of William and Mary
Demonstration by: Matt Smith
When new bonds are formed in the course of a chemical ...

Formal Charges

In some cases, there are seemingly more than one valid Lewis structures for molecules and polyatomic ions. The concept of formal charges can be used to ...

Coordination Chemistry Complexes

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
Transition metals are found everywhere from vitamin ...

Exceptions to the Octet Rule

Many covalent molecules have central atoms that do not have eight electrons in their Lewis structures. These molecules fall into three categories:


	...

determining-rate-laws-and-the-order-of-reaction

Determining Rate Laws and the Order of Reaction

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
All chemical reactions have a specific rate defining the ...

Bond Energies and Bond Lengths

Stable molecules exist because covalent bonds hold the atoms together. The strength of a covalent bond is measured by the energy required to break it, ...

Determining the Empirical Formula

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams - SUNY College of Environmental Science and Forestry
Determining the chemical formula of a compound is at the heart ...

Bonding in Metals

Metallic bonds are formed between two metal atoms. A simplified model to describe metallic bonding has been developed by Paul Dr&#xFC;de called the ...

determining-the-solubility-rules-of-ionic-compounds

Determining the Solubility Rules of Ionic Compounds

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
An ionic compound&#39;s solubility can be determined via ...

atomic-radii-and-effective-nuclear-charge

Atomic Radii and Effective Nuclear Charge

The elements in groups of the periodic table exhibit similar chemical behavior. This similarity occurs because the members of a group have the same number ...

Introduction to Catalysis

Source: Laboratory of Dr. Ryan Richards &#8212; Colorado School of Mines
Catalysis is among the most important fields of modern technology and presently ...

Ionic Radii

Ionic radius is the measure used to describe the size of an ion. A cation always has fewer electrons and the same number of protons as the parent atom; it ...

Introduction to Titration

Source: Laboratory of Dr. Yee Nee Tan &#8212; Agency for Science, Technology, and Research
Titration is a common technique used to quantitatively ...

Le Ch&#226;telier's Principle

Source: Laboratory of Dr. Lynne O&#39;Connell &#8212; Boston College
When the conditions of a system at equilibrium are altered, the system responds in ...

preparing-anhydrous-reagents-and-equipment

Preparing Anhydrous Reagents and Equipment

Source: Laboratory of Dr. Dana Lashley - College of William and Mary
Demonstrated by: Timothy Beck and Lucas Arney
Many reactions in organic chemistry are ...

Proton Exchange Membrane Fuel Cells

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
The United States consumes a large amount of energy &#8211; the current ...

Solutions and Concentrations

Source: Laboratory of Dr. Michael Evans &#8212; Georgia Institute of Technology
A solution is a homogeneous mixture containing some components in small ...

spectrophotometric-determination-of-an-equilibrium-constant

Spectrophotometric Determination of an Equilibrium Constant

Source: Laboratory of Dr. Michael Evans &#8212; Georgia Institute of Technology
The equilibrium constant, K, for a chemical system is the ratio of product ...

using-differential-scanning-calorimetry-to-measure-changes-in-enthalpy

Using Differential Scanning Calorimetry to Measure Changes in Enthalpy

Source: Laboratory of Dr. Terry Tritt &#8212; Clemson University
Differential Scanning Calorimetry (DSC) is a method of thermodynamic analysis based on ...

Schlenk Lines Transfer of Solvents

Source: Hsin-Chun Chiu and Tyler J. Morin, laboratory of Dr. Ian Tonks&#8212;University of Minnesota Twin Cities
Schlenk lines and high vacuum lines are ...

Construct and revise an explanation for the outcome of a simple chemical reaction based on the outermost electron states of atoms, trends in the periodic table, and knowledge of the patterns of chemical properties.

HS-PS1-2.

Chemical Equations

Chemical equations represent the identities and relative quantities of substances involved in a chemical reaction. The substances undergoing reaction are ...

Chemical Reactions in Aqueous Solutions

Chemical substances interact in many different ways. Certain chemical reactions exhibit common patterns of reactivity. Due to the vast number of chemical ...

Precipitation Reactions

In a precipitation reaction, aqueous solutions of soluble salts react to give an insoluble ionic compound &#x2013; the precipitate. The reaction occurs ...

Oxidation-Reduction Reactions

Oxidation&ndash;Reduction Reactions

Earth&rsquo;s atmosphere contains about 20% molecular oxygen, O2, a chemically reactive gas that plays an essential ...

Oxidation Numbers

In redox reactions, the transfer of electrons occurs between reacting species. Electron transfer is described by a hypothetical number called the ...

Acids, Bases and Neutralization Reactions

An acid-base reaction is one in which a hydrogen ion, H+, is transferred from one chemical species to another. Such reactions are of central importance to ...

Synthesis and Decomposition Reactions

Synthesis and decomposition are two types of redox reactions. Synthesis means to make something, whereas decomposition means to break something. The ...

Develop a model to illustrate that the release or absorption of energy from a chemical reaction system depends upon the changes in total bond energy.

HS-PS1-4.

Reaction Rate

The rate of reaction is the change in the amount of a reactant or product per unit time. Reaction rates are therefore determined by measuring the time ...

Measuring Reaction Rates

Polarimetry finds application in chemical kinetics to measure the concentration and reaction kinetics of optically active substances during a chemical ...

Concentration and Rate Law

The rate of a reaction is affected by the concentrations of reactants. Rate laws (differential rate laws) or rate equations are mathematical expressions ...

Apply scientific principles and evidence to explain how the rate of a physical or chemical change is affected when conditions are varied.

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards