הטכניקה מתוארת עבור השתלה four In vivo אלקטרודות לפקח על השליטה neuromuscular התנהגות האכלה Aplysia californica.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג
במאמר זה
סיכום
תקציר
הקלטה של העצבים והשרירים העיקריים של
פרוטוקול
1. אלקטרודה ייצור
- כדי ליצור את האלקטרודה, להשתמש במספריים לחתוך חתיכת אמייל מצופים 0.001 אינץ חוט נירוסטה בקוטר של כ - 2 מטרים. צרף כדור קטן של מרק לכל קצה החוט, מקפלים את החוט לשניים, לסובב את הקצוות כדי ליצור זוג שזור, המכונה אלקטרודה ההפרש.
- סרט בשני קצותיו של חוט כדי למנוע נפרמים. הפוך את ההפרש ארבע אלקטרודות, באמצעות צבע שונה של קלטת של כל אלקטרודה ההפרש למטרות זיהוי (איור 1A).
- טוויסט שני אלקטרודות ההפרש יחד, ומשאיר סנטימטרים untwisted בצד אחד 1 ס"מ בצד השני. חזור עם זוג הנותר של אלקטרודות ההפרש (איור 1B).
- טוויסט שני סטים של שתי אלקטרודות ההפרש יחד, מוודא כי המטרה להישאר untwisted. החזק את הרכבה אלקטרודה וליישם סיליקון דבק משק בצומת של ארבע אלקטרודות ההפרש, והשאיר מסתיים החופשי. חכה ולאפשר הדבק להתייבש במשך 4 שעות לפחות (תרשים 1C).
- כדי לבודד את הענפים, להניח את הרכבה האלקטרודה על משטח שטוח, מטלטלין כגון חתיכת עץ. מניפה את הקצוות ולהבטיח להם את הקלטת. השתמש חתיכה קטנה של פלסטיק להעלות את הרכבה אלקטרודה ממש לפני סניפים, ובטוחה כי עם הקלטת.
- בשלב מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים כדי מעיל הענפים עם דבק סיליקון. 1 אינץ' מסתיים ארוך יהיה בתוך החיה, ולכן הם צריכים מעיל דק מאוד של דבק. אפשר הדבק להתייבש לפחות 3 שעות.
- קצר את סוף 1 אינץ' ארוכה של האלקטרודה אחד ההפרש לשני סנטימטרים. על כל חוט, הסר 1cm של סיליקון אמייל. קורל חוט אחד חשוף לתוך וו הקלטה. לכופף את חוט השני מעלה הרחק הוו, זה יהווה חוט הקרקע. חזור במשך שלוש אלקטרודות הנותרים.
- בחר אחת מארבע אלקטרודות על קצה 2 אינץ. שימוש במלקחיים כדי לגרד את אמייל סיליקון, חשיפת 1cm של חוט חשוף נירוסטה על כל אחד 2 חוטים. הלחמה זהב מחבר אחד משני חוטים. השתמש חתיכת סרט במעבדה כדי להבטיח את הסוף ולשמור על הפרדה בין הקרקע סיכות ההקלטה. חזור במשך שלוש אלקטרודות הנותרים.
- צרף כדור 1-2cm של דבק סיליקון כבל, כ -1.5 ס"מ מהקצה וו לעגן את האלקטרודות בתוך החיה. לייבוש למשך שעה אחת לפחות (1D איור).
באיור 1. האסיפה ייצור אלקטרודה. (א) אלקטרודה בודדת ההפרש הכולל חוט מקופל ומפותל עם הקצוות שלו מאובטח עם הקלטת. (ב) שתי אלקטרודות ההפרש מעוות יחד, והשאיר חלל untwisted בקצוות. סרט בצבעים שונים או אחרת סימון צריך לשמש כדי לזהות את הקצוות. (ג) כל אלקטרודות ההפרש four לשלב ההרכבה אלקטרודה בודדת להרכיב כבל יחיד עם סניפים נפרדים של אלקטרודות בודדים בכל קצה, המסומנים בצבעים שונים של הקלטת. (ד) טופס הרכבה הסופי של האלקטרודה. מצד שמאל, יש מכורבלת ווים הקלטות וחוטי הקרקע של כל אלקטרודה ההפרש. מימין, הפינים זהב כבר מולחמים החוטים לחיבור המגבר. כדור עיגון של סיליקון דבק גם הונחה כלפי הצד השמאלי של הרכבה.
2. הכנת בעלי חיים להשתלה
- בחר בעל חיים בריא שוקל כ 350-450. בתגובה חתיכות קטנות של אצות, החיה צריך ליצור עקיצות במרווחים של בין 3 עד 5 שניות. ניתוח להשלים עם השתלת אלקטרודה צריך לקחת כשעה.
- כדי להרדים את החיה, להזריק את זה עם 30% w / v איזוטוני MgCl 2. כדי למנוע אובדן של hemolymph ו MgCl 2, הזריקה יכולה להיות מצופים בדבק לפני הסרת המחט.
איור 2. תרשים סכמטי המציג את האופן שבו היא חיה ניצח עבור השתלת אלקטרודה, ואת המיקום של החתך (מסומן על ידי בר). - הנח את החיה הרדים את במגש דיסקציה עם הרגל שלה למטה. מול ראש החיה על, משמרת את אזור הזימים עד כה שמאל שהחיה היא חלקית על צידו, נשען לאחור. להצמיד את זרועות קדמית (איור 2).
- מניחים את המגש על הבמה של מיקרוסקופ לנתח. הנכס את המגש בזווית של כ 20 מעלות להעלות את הראש לאסוף את hemolymph בזנב, הרחק מן החתך.
- בעזרת מספריים לנתיחה, להתחיל חתך מעט ימינה שלך eyespot ולהרחיב אותו 1 עד 1.5cm anteriorly. השתמש retractors המצורפת את הקצוות של המגש כדי להחזיק את החתך פתוח (איור 2: חתך ליד בר לב eyespot המצביעים).
- כדי לחשוף את מסת buccal, להשתמש במלקחיים כדי להרים את הקרום מתחת ברוראת העור מספריים להשתמש כדי לחתוך פתח תואמים את החתך המרכזי. טאק את הקצוות של הממברנה לתוך retractors.
3. אלקטרודה השרשה
- מניחים את האלקטרודה על הרכבה micromanipulator והעבר אותו על החתך של החיה.
- העצב radular הוא הקשה ביותר לגישה, ויש ניגש הראשון. ישנן שתי אפשרויות לגישה העצב radular.
- האפשרות הראשונה, שהיא עדיפה, היא להסתכל תחת הגנגליון buccal בין BN1 ו BN2. אם ענף של העצב radular גלוי, להשתמש קנס שקצהו מלקחיים כפופות לתוך וו להרים את ענף (איור 3, לולאה של RN תחת הגנגליון שכותרתו 1).
- אם ענף של העצב radular אינו נגיש מעל השריר, האפשרות השנייה היא לגשת אליו דרך חתך קטן I2 ליד רקמת החיבור בבסיס הגנגליון buccal (איור 3, RN מתחת לשריר שכותרתו 2). החתך I2 חייב לעבור שתי שכבות של שריר I2. תחזיק את הקצה של חתך השריר עם מלקחיים ישר להשתמש במלקחיים מכור לשלוף ענף RN.
- בעוד מחזיק את העצב עם מלקחיים מכור, השתמש קבוצה שונה של מלקחיים כדי לתפעל את הקרס על אלקטרודה לעצב.
- השתמש micromanipulator להעלות את הקרס כך העצב הוא הרים מן המסה buccal וברור של כל עצבים או רקמות אחרות. לא להתמתח יתר על המידה את העצב.
- יבש את האלקטרודה באמצעות קים, נגבו או יניקה את עודף הנוזלים בעזרת מזרק. מתח מים יכול לגרום להתמוטטות עצבים על עצמה, או חותמת מים כדי ליצור תחת העצב. בכל מקרה, האזור צריך להיות יבש לחלוטין לפני דבק מוחל.
- החלת טיפה קטנה של דבק מגע היכן הבסיס של הקרס נמצא במגע עם החלק התחתון של עצב. החל ירידה של Aplysia מלוחים או hemolymph להגדיר בדבק. כאשר הדבק אינו רטוב יש להעביר כפי מקבל דבק בין חוט עצבים יחסום את החיבור החשמלי.
- יבש את הקרס שוב. מערבבים Kwik-סיל דבק על חבילת קרח.
- השתמש קצה סיכה להחיל כמות קטנה של דבק Kwik-סיל, המכסים לחלוטין כל חוט חשוף של הקרס, אך לא את החוט הקרקע.
- אפשר להדביק את להגדיר כ -5 דקות, מתקנים את הדבק אם זה מתרחקת ממקטעים של הקרס. דבק מוגדר כאשר מקלות כבר לא כאשר נגע עם הסיכה (איור 4 מראה את התצורה הסופית).
- לאחר אלקטרודה עצב radular מוגדר, השריר I2 ניתן לגשת. באזור בין BN1 ו BN2, להשתמש במלקחיים מכור להתחבר כדי להפריד 2 להקות של שריר I2 משאר חלקי בשריר על ידי משיכתו בעדינות הלהקות כלפי מעלה. צרף את האלקטרודה באמצעות ההליך אותו.
- עצבים buccal 2 ו -3 ניתן לגשת בקלות אלקטרודות מחוברות עם הליך זהה.
- לאחר שכל האלקטרודות מחוברות, להחליק את הרכבה אלקטרודה לתוך החיה עד עוגן הסיליקון.
- תפר החתך נסגר סביב הכבל אלקטרודה בולטות, שמירה על עוגן בתוך החיה. הפלא את התפרים, כדי להבטיח אטימה טובה.
- הכנס את עצות מחבר זהב בקצה השני של האלקטרודה לתוך בלוק קטן של קלקר. מחזירים את החיה למיכל הראשי במיכל בידוד סודה עבור לילה התאוששות.
איור 3. דיאגרמה של המנגנון האכלה Aplysia המכונה מסת buccal. המוצגים הם עצבים buccal (BN1, BN2, BN3), העצב radular (RN) כי היציאות בתחתית הגנגליון buccal, ולאחר מכן צולל מתחת לשריר, ואת המיקום על השריר I2 שבו אלקטרודה מחוברת.
איור 4. תרשים סכמטי של אלקטרודה אחת מחוברת עצב (או שריר) ו דבוק במקום. שים לב לאזור מבודד של דה וו מכורבלת נמצא בקשר ישיר עם העצב (או שריר), המעוגן במקום עם דבק מגע, ומבודד חשמלית ממדיום את הנוזל באמצעות Kwik-סיל. שים לב גם כי קצה deinsulated של האלקטרודה הקרקע חשופה מדיום הנוזלים.
4. הקלטה
- לאקלם את החיה במיכל סודה בעוד מחובר ציוד ההקלטה לפחות 1.5 שעות. צג את האות בעוד החיה הסתגלות כדי לוודא כי כל אלקטרודות עובדים וכי רמות רעש נמוכות.
- שימוש במצלמת וידאו כדי לתעד התנהגות האכלה תוך כדי שימוש במחשב כדי להקליט אותות עצביים האלקטרודות ושרירי. סנכרן את הקלטות וידאו באמצעות אלקטרודה אות גל מרובע השולט מונה דיגיטלי בתצוגה את המצלמה בזמן שהוא נרשם בו זמנית כערוץ נוסף במחשב ב Axoscope.
- האכלה התנהגויות שהושרו על ידי טכניקות דהscribed ב מורטון Chiel 1993.
אמנם בעלי חיים חסרי חוליות שאינם דורשים אישור רשמי על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים ועדה לטיפול, עלינו להבטיח כי כל הטיפולים של Aplysia למזער את הפגיעה והסבל לחיה, וכי כל טכניקות ניתוחיות מתבצעות בעוד החיה בהרדמה מלאה.
נציג תוצאות
איור 5.) A (סימולטני הקלטות ערוץ לארבעה שריר (השריר מד I2), וכן משלושה עצבים buccal (העצב radular, RN, עצב buccal 2, BN2, ואת העצב buccal 3, BN3) במהלך בתגובה בליעה. (ב) מסגרת עדיין הקלטת וידאו סימולטני של החיה בחופשיות מתנהג כפי שהוא בולע אצות שנחתך מראש פוזרו רצועה (0.5 ס"מ רוחב), אשר סומן על 0.5 ס"מ במרווחים עם להקות לבן כך תנועותיו ניתן דמיינו בקלות כמו החיה הזנות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חדשנות מפתח שהפכה הקלטות הללו מוצלח הוא שילוב של אלקטרודות לתוך כבל אחד. שתי הקלטות אלקטרודה שימשו בעבר, אך מתרחבת עד ארבע אלקטרודות הפרט הביאה להיווצרות הידבקויות כירורגית שלעתים קרובות מנעו מן החי עושה תנועות האכלה רגילה. השילוב בין האלקטרודות לתוך כבל אחד מקטין את כמות גדולה של אלקטרודות בתוך החיה, אשר בתורו מפחית את התגובה החיסונית ומאפשר החיה לנוע בחופשיות רבה יותר.
ההיבט חדשניות אחרות של הליך זה הוא שילוב ש...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
בהכרת תודה אנו מודים תמיכה מ-NIH (NS047073 אל בג"ץ). כמו כן, אנו מודים קתרין Kehl לניסויים המוקדמות שלה עם Kwik-סיל, אשר עודדו אותנו להשתמש בו עבור היישום שלנו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חוט פלדה אל-חלודה מצופה באמייל | California Fine Wire Company | 0.001D, ציפוי h | |
| דבק סיליקון ביתי II | GE Healthcare | ||
| דבק Kwik-Sil | World Precision Instruments, Inc. | ||
| דבק מהיר Duro Qwik-Gel | Henkel Corp | ||
| מגבר A-M Systems דגם 1700 | A-M Systems | הגדרות סינון: 100-1000Hz עצבים, 10-1000Hz שריר I2 | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| פיני חיבור מוזהבים | Bulgin | SA3148/1 | |
| תושבות חיבור מוזהבות | Bulgin | SA3149/1 |
מקורות
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
