$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Sarasija and Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. גידול וסנכרון אוכלוסיית הנמטודות
בעלי חיים אלה יגיעו לשלב הזחל L4 לאחר ~42 שעות. בשלב זה, העבר את זחלי L4 באמצעות פיק פלטינה לצלחות NGM עם זרעי OP50 המכילות 0.5 מ"ג/מ"ל 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) כדי למנוע מהם לייצר צאצאים.
NOTE ודא שבמהלך ניסוי כל הזנים מסונכרנים למשך פרק זמן דומה. טיפול FUdR מעקר את בעלי החיים ומונע הטלת ביצים וייצור צאצאים, מה שעלול להשפיע על OCR. בעלי חיים מעוקרים אלה ינותחו למחרת (יום 1 בעלי חיים בוגרים ב~ 66 שעות) לבדיקה. דווח כי FUdR משפיע על הפיזיולוגיה ותוחלת החיים של תולעים מוטנטיות מסוימות. לכן, זה צריך להילקח בחשבון כאשר התרופה משמשת לעיקור. ניתן לעקר תולעים גם באמצעות מוטציות נשיות כגון fem-1(hc17) או fem-3(e2006). עם זאת, מוטציות אלה עשויות להשפיע על תפקוד המיטוכונדריה.
- העבירו זחלי L4 בעלי רקע גנטי רצוי (למשל, N2 [סוג בר] ובעלי חיים מסוג sel-12) על צלחות של מצעי גדילה של נמטודות (NGM) (ראו טבלה 1 למתכון) שנזרעו טריים עם מדשאה של Escherichia coli (OP50). השתמש לפחות בשני לוחות בקוטר 100 מ"מ או שלושה לוחות בקוטר 60 מ"מ לכל זן. לדגור על התולעים בטמפרטורת הגידול המתאימה (בין 15-25 מעלות צלזיוס) במשך 3-4 ימים או עד ריכוז הצלחות עם מספר רב של ביצים ותולעים גרבידיות.
- שטפו את הביצים והתולעים מהצלחות באמצעות כ-6 מ"ל של חיץ M9 (ראו טבלה 1 למתכון) לכל צלחת נמטודות בקוטר 100 מ"מ והעבירו אותן עם פיפטות פסטר מזכוכית לצינורות צנטריפוגות בודדות של 15 מ"ל לכל זן. סובבו את הצינורות האלה במשך 3 דקות במהירות של 6,180 x גרם ושאפו החוצה את חיץ M9, תוך שמירה רק על בעלי החיים וגלולות הביצים.
- יש להוסיף 3-4 מ"ל של תמיסת אקונומיקה (ראו טבלה 1 למתכון) לכל צינור ולערבל לסירוגין למשך 6 דקות. להוסיף חיץ M9 כדי למלא כל צינור ולסובב ב-6,180 x גרם למשך דקה אחת ולשאוף סופרנטנט. חזור על שטיפה זו עם M9 שלוש פעמים והעבר את גלולת הביצה לצינור טרי של 15 מ"ל המכיל כ -9 מ"ל של חיץ M9.
- סנכרנו את התולעים שזה עתה בקעו על ידי אגוז בטמפרטורה של 20°C למשך 16–48 שעות. סובבו את הצינורות האלה למטה בטמפרטורה של 6,180 x גרם למשך דקה וחצי והניחו את חיות L1 המסונכרנות על צלחות NGM בודדות שנזרעו זה עתה עם מדשאה של OP50 (בערך 6,000–10,000 בעלי חיים לכל צלחת של 100 מ"מ) ושמרו על טמפרטורה של 20°C.