מאמר שיטה

יצירת ספרואידים מקווי תאים: שיטת תרבית תאים תלת ממדית (3D)

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Dillard, P., et al. A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

ספרואידים הם סוג של מודל תרבית תאים תלת-ממדי המשמש לייצוג מדויק יותר של סביבת התא בהשוואה למודלים חד-שכבתיים של תרבית תאים דו-ממדית. בפרוטוקול לדוגמה, נראה מדענים מייצרים ספרואידים מקו תאים של סרטן המעי הגס ומיישמים הדמיה של תאים חיים כדי לעקוב אחר גדילת הספרואידים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת ספרואידים מקו תאי סרטן המעי הגס

  1. יש לשטוף HCT 116 (מומר ביציבות כדי לבטא אשכול התמיינות 19 (CD19) וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)) חד-שכבות של תאים עם מלח חוצץ פוספט (PBS; 5 מ"ל עבור 25 ס"מ2 או 10 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות). מוסיפים טריפסין (0.5 מ"ל עבור 25 ס"מ2 או 1 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות) ולדגור על תאים ב 37 ° C במשך 5 דקות.
  2. בדוק את ניתוק התא תחת מיקרוסקופ ונטרל אנזים דיסוציאציה של תאים עם מדיום שלם של Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycin; 10 מ"ל עבור 25 ס"מ2 או 20 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות).
  3. מתלה תאי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. להסיר supernatant באמצעות פיפטה ו resuspend על ידי pipeting למעלה ולמטה מספר פעמים עם 5 מ"ל של סל"ד מלא 1640 בינוני.
  4. ספירת תאים באמצעות אי-הכללה כחולה של Trypan במונה תאים תואם.
  5. תרחיף תאי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. להסיר supernatant באמצעות פיפטה ו resuspend בתווך RPMI כדי לקבל 5 x 103תאים / מ"ל.
  6. מצפים צלחת תחתונה עגולה 96 באר עם 100 μL / באר של 100 מיקרוגרם / מ"ל של פולי-L-ליזין (PLL) ב PBS במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. שטפו פעמיים עם PBS ותנו לצלחת להתייבש.
  7. מעבירים את תרחיף התא למאגר סטרילי ומחלקים 200 μL/באר לתוך לוחות תחתונים עגולים מצופים PLL של 96 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
  8. מעבירים את הצלחת למכשיר ההדמיה האוטומטי בתוך אינקובטור (37°C, 5% CO2, 95% לחות).
  9. היכנס לתוכנת הרכישה, בחר תזמון לרכישה | הפעל הוסף כלי | סריקה לפי לוח זמנים | צור כלי שיט: חדש.
  10. בחר סוג סריקה: Spheroid. בחר את ערוצי העניין: שלב + Brightfield (כדי לעקוב אחר צמיחת ספרואידים), ירוק (כדי לעקוב אחר אות הגידול, זמן רכישה 300 ms) ואדום (כדי לעקוב אחר אפופטוזיס, זמן רכישה 400 ms).
    1. בחר את ההגדלה הרצויה: 10x.
    2. בחרו את דגם הצלחת ואת מיקומה במגירה. בחר את מיקום הבארות לתמונה. הזן את תיאור הניסוי: שם, סוג תאים, מספר תאים.
  11. עבור הגדרת הניתוח, בחר דחה ניתוח עד מאוחר יותר. לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן ובחר באפשרות הגדר מרווח קבוצת סריקה שנבחרוהגדר הוסף סריקות כל 4 שעות ובסך הכל עד 24 שעות. הגדר את זמן ההתחלה הרצוי (לפחות שעה לאחר הדגירה במנגנון ההדמיה האוטומטי).
  12. בדוק כל יומיים את הצמיחה של ספרואידים על ידי כניסה לתוכנת ההדמיה.
    1. בחר באפשרות הצג סריקות אחרונות ולחץ פעמיים על הניסוי הרצוי. בחרו Brightfield בחלונית 'ערוצי תמונה' ולאחר מכן השתמשו בכלי מדידת תכונות תמונה למדידת קוטר הספרואידים. לוקח 6 ימים עד שספרואיד מגיע לגודל הרצוי: קוטר 0.5 מ"מ. הוסף 50 μL של מדיום RPMI מלא לכל באר ביום 4 כדי להגביל את אפקט האידוי הבינוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1304px;" width="1306"> רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה שם חברה מספר קטלוג הערות Dulbecco's Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH D8537-500ML מספר פריט: RNBG7037 75 ס"מ² צלוחיות שטח צמיחה VWR 430639 פריט מספר: 2218002 75 ס"מ² צלוחיות שטח צמיחה VWR 734-2705 פריט מספר: 3718006 Trypsin-EDTA SIGM-ALDRICH T3924-100 מ"ל פריט מספר: SLBTO777 RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 מ"ל טכנולוגיית חיים (Gibco) 21875-091 פריט מספר: 1926384 Gentamicin תרמו פישר 15750060 פריט מספר: 1904924A Trypan Blue Solution, 0.4% תרמו פישר 15250061 פריט מספר: 1886513 96 צלחת באר, תחתית עגולה VWR 734-1797 פריט מספר: 33117036 X-VIVO 15 עם Gentamicin L-Gln, פנול אדום, 1 L ביונורדיקה BE02-060Q פריט מספר: 8MB036 מאגר מגיבים VWR 89094-672 פריט מספר: 89094-672 15 מ"ל צינורות VWR 734-1867 פריט מספר: 19317044 סרום בקר עוברי גיבקו 10500064 פריט מספר: 08Q3066K HCT 116 קו קרצינומה של המעי הגס ATCC CCL-247 - Incucyte S3 אסן ביוסיינס

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים