אלקטרוקרדיוגרפיה של דגי זברה (ECG): בדיקה זעיר פולשנית להערכת תפקוד הלב

תקציר

מקור: Zhao, Y., et al. In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מראה כיצד לבצע מדידות אלקטרוקרדיוגרפיה (ECG או EKG), בדיקה המודדת את הפעילות החשמלית של הלב, על דג זברה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp.(2019).

כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים של בעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UCLA.

1. השראת הרדמה

1. הכינו הרדמה טבילה לשליטה בכאב והשתקת דגים כדי למנוע מחפצים תנועתיים במהלך איסוף נתוני אק"ג. רוב המעבדות משתמשות בטבילה טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט, MS-222).
   1. כדי להפוך את תמיסת הטריקאין ל-0.4% במלאי, שלבו את הפריטים הבאים בבקבוק זכוכית כהה עם ברג: 400 מ"ג אבקת טריקאין, 98 מ"ל מים מזוקקים כפול ו-2 מ"ל של 1 M Tris (pH 9). יש לכוונן ל-pH 7.0 באמצעות 1 N NaOH או 1 N HCl לפי הצורך.
   2. כדי להפוך את פתרון הטבילה הסופי של הטריקאין, קבע את הריכוז המינימלי המתאים לגיל דג הזברה, גודלו, מצבו המטבולי, הזן, מודל המחלה, המטרות המדעיות ומשך הזמן הפרוצדורלי.
   3. בצע מחקר תגובת ריכוז טריקאין, טיטרציה למעלה או למטה מהריכוז המומלץ של 168 מ"ג / ליטר (או 0.0168%)⁹במידת הצורך, כדי להשיג רמה 4 של הרדמה תוך 3 דקות עם כמה שפחות רעילות לב-ריאה אפשרית. לדוגמה, במחקר זה, טבילה של דגי זברה מסוג AB פראי בגיל 12-18 חודשים בתמיסת טריקאין של 0.02-0.04% תגרום לרמה 4 של הרדמה תוך 3 דקות.
      NOTE: ברמה 4 של הרדמה, שיווי המשקל וטונוס השרירים הולכים לאיבוד לחלוטין וקצב התנועה הניתוחית מופחת.
   4. במידת הצורך, יש להתייעץ עם הווטרינר בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לקבלת הנחיות נוספות לגבי נאותות בחירת חומרי ההרדמה ומסלול המתן.
2. טבלו דג זברה בוגר בצלחת המכילה תמיסת טריקאין בריכוז הנמוך ביותר שנקבע מראש ואושר על ידי IACUC (למשל, 0.02-0.04% במחקר זה) כדי לגרום לרמה 4 של הרדמה תוך 3 דקות (איור 1).
   1. לפרוטוקול אק"ג הישרדותי, שמור על הקלטת אק"ג קצרה ככל האפשר (מתחת ל -10 דקות). עבור הקלטות אק"ג קצרות הנמשכות פחות מ -15 דקות, אין צורך בתחזוקת הרדמה.
   2. להקלטות אק"ג ארוכות הנמשכות שעות, השתמשו בשיתוק תוך שרירי ארוך טווח ובמערכת זילוח אוראלית כדי לספק הידרציה וחמצון בשפע.

2. מיקום עופרת א.ק.ג.

1. ברגע שדגי הזברה שומרים על רמה 4 של הרדמה במשך 3 שניות, השתמשו בזוג מלקחיים קהים כדי להעביר את הדג מיד לחריץ הספוג הלח עם משטח הגחון העליון שלו לצורך מיקום אלקטרודות עופרת אק"ג (איור 2).
2. הכניסו בעדינות את שלוש אלקטרודות עופרת האק"ג לשרירי הדג לעומק של כ-1 מ"מ כדי ליצור עופרת דו-קוטבית במישור הקדמי המקביל לכיוון הגולגולת השמאלית-קאודלית-ימנית של הציר הראשי של הלב.
3. מקמו את האלקטרודה החיובית (האדומה) בקו האמצע הגחוני בגובה הבולבוס ארטריוזוס, כלומר 1-2 מ"מ מעל קו דמיוני המחבר בין שני הקצוות התחתונים של האופרקולומים (איור 2A).
4. מקמו את האלקטרודה השלילית (השחורה) באופן קאודלי ו-0.5-1.0 מ"מ שמאלה לרוחב לאלקטרודה החיובית, במרחק גדול מהאורך האפיקובזאלי המרבי של חדר דג הזברה הבוגר (איור 2A).
5. מקם את אלקטרודת הייחוס (ירוקה) באופן קאודלי, ליד אזור פי הטבעת.
   NOTE: מכיוון שהציר הראשי של הלב משתנה במידת מה מדגים לדגים, כדי למקסם את אמפליטודות הגלים R ו- T, התאימו את מיקומי העופרת על ידי ביצוע שינויים קטנים ושיטתיים בלבד באמצעות ניסוי וטעייה. לדוגמה, שנה אלקטרודה אחת (חיובית או שלילית), במקום שתי האלקטרודות, בכל פעם, ובצע שינויים הדרגתיים בכיוון מסוים אחד לפני שתשנה לכיוון אחר במקום לבצע שינויים לא יציבים בכיוונים אקראיים.

3. הקלטת אק"ג

1. פתח את תוכנית רכישת הנתונים של אק"ג. בחר הגדרה רצויה מהתפריטים הנפתחים עבור טווח, מעבר נמוך ומעבר גבוה. לדוגמה, ההגדרה הבאה במערכת הקלטת האק"ג in vivo המשמשת בניסוי זה מניבה יחס אות לרעש עקבי ומספק עבור דג זברה בוגר רגיל: טווח "2 mV", מעבר נמוך "120 הרץ" ומעבר גבוה "0.03 שניות".
2. לחץ על Start כדי להתחיל בהקלטת אק"ג רציפה ללא פערים בקצב דגימה של 1 kHz.
3. כדי למטב את מיקום העופרת לקבלת יחס אות לרעש מרבי, לחץ על עצור כדי להפסיק את הקלטת האק"ג ולסקור את מעקב האק"ג מיד לאחר ניסיון ההקלטה הראשון עבור כל לב. כדי לאבחן שאק"ג של דג זברה בוגר תקין, ודא שכל ארבעת קריטריוני האימות הבאים מתקיימים (איור 3):
   1. קריטריון 1: ודא שכל צורות הגל של אק"ג (P, QRS ו-T) מובחנות ונראות לעין.
   2. קריטריון 2: ודא שגל P הוא חיובי.
   3. קריטריון 3: ודא שקומפלקס QRS נטו הוא חיובי (כלומר, משרעת גל R גדולה מסכום אמפליטודות הגל Q ו- S).
   4. קריטריון 4: ודא שגל T הוא חיובי.
4. אם צפוי אק"ג תקין, מקם מחדש את האלקטרודות (נסה תחילה את האלקטרודה השלילית) במידת הצורך, עד שכל ארבעת קריטריוני האימות יתקיימו.
5. אם צפוי גל T רגיל, אך גל T קטן מדי, מקם מחדש את האלקטרודות כדי למקסם את משרעת גל T.
6. חדש את הקלטת האק"ג לאחר אופטימיזציה של מיקום העופרת. שמור את מטאטא האק"ג לניתוח הבא.

4. התאוששות מהרדמה

1. בסוף הקלטת האק"ג, הסר בזהירות את האלקטרודות מבלי לפגוע בדגים. מעבירים את הדגים למי דגים טריים ומחומצנים ללא טריקאין.
2. כדי להקל על ההתאוששות מההרדמה, יש להשפריץ מים על הזימים במרץ עם פיפטת פסטר עד שהדג חוזר לתנועת זימים סדירה או לשחייה.
3. עקוב אחר הדג להתאוששות מלאה מהרדמה (בדרך כלל 1-2 דקות), כפי שמצוין על ידי היכולת של הדג לשחות זקוף במשך 5 שניות לפחות.

תוצאות

איור 1: פרוטוקול רישום אק"ג זעיר פולשני in vivo. תרשים זרימה סכמטי מדגים ארבעה שלבי פעולה קריטיים בביצוע חקירת אק"ג in vivo: השראת הרדמה, מיקום אלקטרודות עופרת אק"ג, רישום אק"ג וניתוח רישומי האק"ג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיקום עופרת אק"ג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מנות תרבות	פישר סיינטיפיק	FB087571	100 מ"מ x 20 מ"מ
מלקחיים Dumont	כלי Sciense עדינים	11253-20	0.1 × 0.06 מ"מ
FE136 מגבר ביו של בעלי חיים	מכשירי AD	FE231
איריס מלקחיים	כלי Sciense עדינים	11064-07	0.6 × 0.5 מ"מ
LabChart 8 Pro	מכשירי AD		תוכנה עם מודול אק"ג
אלקטרודות מחט עבור Animal Bio Amp	מכשירי AD	MLA1213	מד 29
פייפטי העברה חד פעמיים מפלסטיק	פישר סיינטיפיק	13-669-12	6 אינץ', 1.2 מ"ל
PowerLab 4/35	מכשירי AD	4//35
טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט)	סיגמא	E10521-10G	MS-222