$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Gervaise and Arur, ניתוח מרחבי וזמני של ERK פעיל ב- C. elegans Germline. J. Vis. Exp.(2016).
1. נתיחת תולעים בוגרות להשגת גונדות
- בחר 100 - 150 WT (N2) או גנוטיפ רצוי של תולעים בשלב ההתפתחותי הרצוי והספציפי (L1, L2, L3, L4, בוגר וכו ') ב 100 μL של חיץ M9 בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- מלא את צינור המיקרוצנטריפוגה ב-900 μL של חיץ M9 (ראה טבלת חומרים). צנטריפוגה את הצינורות ב 1,000 x גרם במיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת בטמפרטורת הסביבה.
- הסר בעדינות 900 μL של מאגר M9 והשליך. הסר את החיץ מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי להבטיח שהתולעים לא יוסרו בטעות.
- חזור על שלבים 1.2 - 1.3 פעמיים נוספות עם מאגר M9 טרי בכל פעם. זה מבטיח שכל החיידקים שנשאו עם התולעים יישטפו ביעילות.
- לאחר השטיפה הסופית, יש להסיר 900 μL של חיץ M9 מהצינור ולהשליך.
- העבירו את 100 μL הנותרים של חיץ M9 המכיל את 100 - 150 התולעים עם קצה מיקרופיפטה של 200 μL לצלחת שעון זכוכית תחתונה שטוחה. ודא כי קצה micropipette נחתך בסימן 10 μL לפני השימוש. אי חיתוך הקצה יגרום לגזירה של התולעים.
- הוסף 1 - 3 μL של 0.1 M levamisole לצלחת שעון זכוכית המכילה את התולעים במאגר M9. מערבלים בעדינות את הלבמיסולה ואת ה-M9 כדי לאפשר ערבוב אחיד עד שהתולעים מפסיקות לזוז.
NOTE: ניתן לאחסן מלאי Levamisole ב -20 °C לאחסון לטווח ארוך. כאן, להשתמש בריכוז גבוה יותר של 1 - 3 mM ממה שתואר בספרות23 של 0.2 - 0.25 mM של levamisole על מנת להשיג אובדן מהיר של ניידות אצל בעלי החיים. אם החיות מסתובבות זמן רב מדי בתרחיף הנוזלי, הדפוסים המתקבלים של dpERK בגונדות יכולים להיות משתנים (עקב לחץ או חוסר תזונה או שניהם). דפוסי צביעה ניתנים לשחזור יותר הושגו עם 1 - 3 mM levamisole לדיסקציה.
- חבר שתי מחטים של 25 גרם לשני מזרקים של 1 מ"ל (גודל המזרק לא משנה, מד המחט הוא קריטי). מקמו מזרק אחד בכל יד (איור 1).
- תחת מיקרוסקופ מנתח, מקמו כל מחט מתחת לכל תולעת ומעליה, כפי שמוצג באיור 1, והניחו חתך דק על התולעת ליד פקעת הלוע השנייה בתנועה דמוית מספריים. לאחר חתך אחד בתולעת עוברים לחיה הבאה עד שכל החיות בצלחת נחתכו לפחות פעם אחת.
NOTE: שים לב ששלבים 1.8 - 1.9 רגישים לזמן. נתחו את כל התולעים בצלחת תוך פחות מחמש דקות לקבלת תבנית dpERK הניתנת לשחזור. זמני נתיחה ארוכים יותר יגרמו לכיבוי אות dpERK, במיוחד באזור 1. התאימו את מספר התולעים בכל סבב דיסקציה (כלומר, 50 תולעים לעומת 150) במידת הצורך כדי להישאר במסגרת הזמן שהוקצבה.
- במקרה שגונאד מושחל אינו נראה לעין במהלך הנתיחה, אל תנסה חתך נוסף באותה חיה. בדרך כלל זה רק יגזור את החיה ולא יגרום לאקסטרוזיה של הגונדה. במקום זאת, עברו לחיה הבאה. תולעים שבהן הגונדות אינן מתפשטות יופיעו ככאלה בשקופיות שיוכנו בסעיף 6 וניתן יהיה להתעלם מהן במהלך ההדמיה
NOTE: בכל שלבי הנתיחה והעיבוד, חשוב לזכור שהגונד יישאר מחובר לגוף/פגר. אין להפריד בכוח את הגונד ואת הגוף עם המחט. פעמים רבות קרע חריג ברקמת הגונדל בניסיון לנתק את הגונד מהגוף עלול לגרום לאות נוגדנים מזויף. ניתן להתעלם מהגופה/הפגר במהלך שלבי ההדמיה, ורק מהגונד מצולם. בנוסף, לעיתים תאי המעי יכולים לשמש גם כבקרות פנימיות / בקרות סומטיות עבור הנוגדן הנבדק.
איור 1: הדגמה של מיקומי מחטים במהלך נתיחות. משמאל: תצלום של דיסקציה בתהליך. מימין: מיקום המחט ביחס לתולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
