PCR תולעת יחידה: שיטה לחלץ ולהגביר DNA גנומי

תקציר

מקור: Prior, H., et al. צינור מהיר ומהיר ליצירת מוטנטים נקודתיים גנומיים ב-C. elegans באמצעות ריבונוקלפרוטאינים CRISPR/Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

סרטון זה מתאר טכניקה לסינון מהיר של נמטודה בודדת לאיתור סמן גנטי על ידי בדיקת PCR. בפרוטוקול לדוגמה, אנו בודקים עריכת גנום מבוססת קריספר.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PCR תולעת יחידה וגנוטיפ

1. לאחר 1-2 ימים של הטלת ביצים, העבירו את ה-F₁s למכסי צינור רצועת PCR נפרדים המכילים 7 מיקרוליטר של חיץ ליזיס תולעת באמצעות פיק תולעים (טבלה 1, איור 1D, יום 4 - 5).
2. צנטריפוגות PCR צינורות במהירות מקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להביא בעלי חיים לתחתית הצינור, ולהקפיא צינורות ב -80 ° C למשך 1 h.
   NOTE: תולעים ניתן לאחסן ב -80 °C ללא הגבלת זמן.
3. ליז תולעים קפואות thermocycler באמצעות התוכנית הבאה: 60 ° C במשך 60 דקות, 95 ° C במשך 15 דקות, 4 ° C להחזיק.
4. הגדרת מאסטרמיקס PCR כפי שמוצג בטבלה 2.
5. הוסף 21 μL של מאסטרמיקס PCR לתוך צינורות PCR נקיים, ולאחר מכן להוסיף 4 μL של ליזה תולעת משלב 3. יש לערבב היטב באמצעות פיפטה ולהפעיל תוכנית PCR בהתאם להנחיות היצרן (ראה טבלת חומרים).
6. לטהר תגובות PCR באמצעות ערכת DNA Clean and Concentrate, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לחדד DNA על ידי הוספת 10 μL מים לעמודת הספין.
7. הגדרת תבנית מאסטרמיקס של אנזימי הגבלה כפי שמוצג בטבלה 3.
8. הוסף 10 μL של אנזים הגבלה mastermix לכל תגובת PCR ניקה לדגור במשך 1 - 2 שעות ב 37 ° C.
9. יש להפריד מוצרי PCR מעוכלים על ג'ל אגרוז 1.5% במתח של 120 וולט באמצעות מאגר Tris-אצטט-EDTA (TAE) אחד.

תוצאות

איור 1. הנדסת CRISPR-Cas9 של מוקד C. eleganssod-1. (A) איור סכמטי המתאר את המבנה האקסון-אינטרון של מוקד סוד-1 ב-C. elegans. הפס האדום מציין את המיקום של G93 באקסון 3. ערכת זוגות הפריימרים מצוינת על ידי החיצים האדומים (F1-R1). (B) יישור רצף של חלבוני SOD-1 אנושיים וחלבוני C. elegans (תולעת). שאריות ה-G9...

חומרים

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:839px;" width="839"> רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה שם חברה מספר קטלוג הערות Nuclease-free water Synthego Inc. מסופק עם ערכת sgRNA ערכת EZ KCl סיגמא P5405 DNA Clean &; Concentrator מחקר זימו D4004 Zymoclean ג'ל ערכת שחזור DNA מחקר זימו D4002 Q5 Hot Start High Fidelity 2X Master Mix מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד M0494L Proteinase K סיגמא עמ' 2308 MgCl2 סיגמא M2393 NP-40 סיגמא 74385 Tween-20 פישר סיינטיפיק BP337-100 RNaseZap פתרון טיהור פישר סיינטיפיק AM9780