צביעת הנילוס האדום של C. elegans: שיטה לדמיין טיפות שומנים בבעלי חיים קבועים

תקציר

מקור: Escorcia, W., et al. כימות שפע שומנים והערכת פיזור שומנים ב- Caenorhabditis elegans על ידי Nile Red ו- Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר פרוטוקול להכתמת שומנים בתולעים שלמות וקבועות באמצעות צבע אדום הנילוס. כדי לראות באופן ספציפי את השומנים הניטרליים בליבת טיפות השומנים, דמיינו את ספקטרום הפליטה הירוק של C. elegans המוכתמים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. אדום הנילוס (NR) צביעת שומנים

1. הכנת תמיסת מלאי NR 5 מ"ג/מ"ל
   1. בבקבוק של 500 מ"ל, הוסיפו 100 מ"ג אבקת NR ל-200 מ"ל של 100% אצטון.
   2. כסו את הבקבוק ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.
   3. לפני השימוש, מערבבים את התמיסה במשך שעתיים בחושך.
   4. לשימוש ארוך טווח, אחסנו את תמיסת NR בבקבוק אטום היטב ללא חשיפה לאור. קנה מידה של פתרון מלאי NR בהתאם לצרכי המחקר. ודא שאותו פתרון מלאי משמש בניסויי צביעת NR כדי להשיג תוצאות עקביות של צביעה והדמיה.
2. הכנת פתרון עבודה NR
   1. עבור כל 1 מ"ל של 40% איזופרופנול (v/v), הוסף 6 μL של תמיסת NR מלאי.
   2. הכן 600 μL של פתרון עבודה NR עבור כל מדגם.
      NOTE: הכינו פתרון עבודה NR טרי ממש לפני הצביעה. בהתאם לצרכי פתרון מלאי NR, השתמש בצינור חרוטי מדורג של 15 מ"ל או 50 מ"ל.
3. הכנת תולעים לצביעת שומנים NR
   1. לגדל תולעים עד שלב L4 מוקדם ב 20 ° C על נמטודה גידול בינוני (NGM) זרע עם רישום מאוחר OP50 E. coli.
   2. שטפו את התולעים מהצלחת עם 1 מ"ל של 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט + תמיסת טריטון X-100 (PBST) 0.01% והכניסו את תרחיף התולעת לצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל.
   3. צנטריפוגה את התולעים ב 560 x גרם במשך 1 דקה. להסיר את supernatant ולחזור על שלב זה עד E. coli הוא ניקה מן התרחיף.
   4. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 40% איזופרופנול לגלולת התולעת ודגרו עליה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
   5. צנטריפוגו את התולעים ב 560 x גרם במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant מבלי להפריע גלולת התולעת.
      NOTE: השתמשו בכמויות גדולות יותר של PBST כדי לשטוף את התולעים מהצלחות אם אתם משתמשים בצלחות גדולות יותר או מכתימים יותר תולעים בכל צלחת. אין לשטוף את התולעים ב-PBST יותר מ-15 דקות לפני קיבוע הדגימה. בצעו שטיפות נוספות אם הסופרנאטנט אינו נקי מחיידקים. בצע את הדגירה ב 40% isopropanol באמצעות nutator או נדנדה. עקוב תמיד אחר הצינורות כדי לוודא שמתרחשת תסיסה מלאה של הדגימה.
4. צביעת שומנים עם NR
   1. בחושך, הוסף 600 μL של פתרון עבודה NR לכל דגימה. הפוך את הצינורות שלוש פעמים וערבב לחלוטין את התולעים בתמיסת NR.
   2. סובבו את הדגימה בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
   3. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את התולעים ב 560 x גרם במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
   4. הוסף 600 μL של PBST ודגר על הדגימות בחושך במשך 30 דקות כדי להסיר כתם NR עודף.
   5. צנטריפוגה את הדגימות ב 560 x גרם במשך 1 דקות ולהסיר את כל למעט כ 50 μL של supernatant.
      NOTE: אינקובציה NR אינה דורשת תסיסה. התיישבות של תולעים נפוצה בשלב זה.
5. הכנת שקופיות להדמיית מיקרוסקופ
   1. השהה מחדש את גלולת התולעת בשארית סופרנטנט.
   2. הניחו 5 μL של תרחיף תולעת על מגלשת מיקרוסקופ והניחו כיסוי בזהירות כדי למנוע לכידת בועות אוויר.
   3. יש לאטום את הכיסוי בלק לפני הדמיה של תולעים.
   4. הכינו רק כמה שקופיות בכל פעם. זה יבטיח שהדמיית NR תישאר קבועה בכל הדגימות. איכות התמונות המוכתמות ב-NR פוחתת לאחר 6 שעות. קשה להבחין בטיפות שומנים בדידות ופלואורסצנטיות הרקע עולה, מה שמפריע לזיהוי אות NR.
6. הדמיה של תולעים מוכתמות ב-NR
   1. דמיינו את התולעים בהגדלה של פי 5 כדי ללכוד מספר בעלי חיים בכל שדה ראייה.
   2. עבור להגדלה פי 10 לכימות טוב יותר של תולעים בודדות.
   3. השתמשו בערוץ FITC/GFP כדי לצלם תולעים מוכתמות ב-NR ונסו זמני חשיפה שונים כדי לקבוע את התנאים האופטימליים לכימות.
   4. שמור קבצים בפורמט TIF כדי למנוע אובדן נתונים עקב דחיסה.
      NOTE: זמני חשיפה אופייניים נעים בין 100-1000 מילישניות. לאחר זמן חשיפה אופטימלי, השתמש בו עבור כל הדגימות כדי לשמור על עקביות ההדמיה.

חומרים