דיסוציאציה של תא בודד של Caenorhabditis elegans: שיטה לבודד תאים חיים

תקציר

מקור: גרמניה, E. M., et al. בידוד אוכלוסיות נוירונים ספציפיות מתולעת עגולה Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון וידאו זה מתאר שיטה לניתוק תולעים שלמות לתרחיף חד-תאי המתאים ל-FACS או משקעים חיסוניים של תאים שלמים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מגרמניה ואחרים, בידוד אוכלוסיות נוירונים ספציפיות מתולעת עגולה Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).

1. הכנה ואיסוף של תולעים ישנות לבידוד תאים

הערה: הסבר להלן הוא בידוד של נוירונים כולינרגיים מזן unc-17::GFP מהונדס (OH13083) המתקבל ממאגר הזנים Caenorhabditis Genetics Center (CGC) באוניברסיטת מינסוטה. חובה לשמור על תנאים סטריליים כדי למנוע זיהום מפטריות או חיידקים.

1. הכינו וסנכרנו תולעים בשיטת ההלבנה כמתואר על ידי T. Stiernagle. עבור ניסויי הזדקנות, תולעי צלחות על צלחות מדיום גידול נמטודות (NGM) המכילות תמיסת מים של 25 מיקרומטר של פלואורודאוקסיורידין (FuDR) כדי להפחית את ייצור הביצים ולעצור את בקיעת הביצים. בדוק צלחות אגר באופן קבוע כדי למנוע זיהום או בקיעת ביצים מכיוון שזה יגרום לתוצאות לא אמינות.
   NOTE: עבור תאי unc-17::GFP, בדרך כלל שלושה לוחות NGM בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ משמשים לבידוד כמות מספקת של תאים מעניינים.
2. אספו תולעים והכינו מאגרים לבידוד תאים.
   1. לאסוף תולעים בצינור חרוטי 15 מ"ל. יש לשטוף תולעים מהצלחת עם 1.5 מ"ל של חיץ M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,600 x גרם. יש להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף תולעים עם 1 מ"ל של חיץ M9. חזור על הצנטריפוגה ושטוף בסך הכל חמש פעמים כדי להסיר זיהום E. coli ככל האפשר.
      NOTE: הוספת אנטיביוטיקה (50 מיקרוגרם/מ"ל), כגון אמפיצילין, בשלב זה יכולה לסייע בהפחתת זיהום חיידקי.
   2. עבור שתי דגימות, להכין 2 מ"ל של סודיום דודציל סולפט-dithiothreitol (SDS-DTT) חיץ ליזיס: 200 mM DTT, 0.25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0), ו 3% (w / v) סוכרוז.
   3. הכינו 15 מ"ל של חיץ בידוד (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) ואחסנו אותו על ice.
      NOTE: גם מאגר הליזה SDS-DTT וגם מאגר הבידוד חייבים להיות טריים לפני כל ניסוי.
3. הפרעה בקוטיקולה ובידוד תא בודד
   1. חיות צנטריפוגות שנאספו בשלב 1.2.1 למשך 5 דקות במהירות של 1,600 x גרם. הסר את כל תולעי העל וההשהיה ב 1 מ"ל של מדיה M9 והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
   2. תולעי גלולה עם צנטריפוגה ב 1,600 x גרם במשך 5 דקות.
   3. הוסף 200 μL של חיץ ליזיס SDS-DTT לתולעים ודגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תולעים צריכות להיראות "קורצות" לאורך הגוף אם מסתכלים עליהן תחת מיקרוסקופ אור.
      NOTE: חשיפה ממושכת לחיץ ליזה SDS-DTT עלולה לגרום למוות של תולעים, אשר ניתן לנטר על ידי התבוננות בתולעים. תולעים מתות יתארכו ולא יתכרבלו.
   4. יש להוסיף 800 μL של חיץ בידוד קר כקרח ולערבב באמצעות צינור מהבהב בעדינות.
   5. תולעי גלולה למשך דקה אחת ב 13,000 x גרם ב 4 ° C, להסיר supernatant ולשטוף עם 1 מ"ל של חיץ בידוד.
   6. חזור על שלב 1.3.5 בסך הכל חמש פעמים, והסר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם.
   7. הוסף 100 μL של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus (15 מ"ג / מ"ל) (טבלה של חומרים) מומס בחיץ בידוד לגלולה ולדגור במשך 10-15 דקות ב RT.
      NOTE: בדומה למאגר הליזה SDS-DTT, עיכול הפרוטאז המורחב עלול לגרום לפיצול יתר של חלבונים לאורך קרום הפלזמה, ולמנוע בידוד של GFP שנחשף בפני השטח באמצעות חרוזים מגנטיים.
   8. במהלך הדגירה עם תערובת פרוטאז, יש למרוח הפרעה מכנית על ידי דגימות צנרת למעלה ולמטה כנגד תחתית צינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם קצה מיקרופיפטה של 200 מיקרו-ליטר למשך ~60-70 פעמים. שמור את קצה פיפטה על הקיר של צינור microcentrifuge עם לחץ קבוע כדי לנתק כראוי תאים.
   9. כדי לקבוע את שלב העיכול, הסר נפח קטן (~ 1-5 μL) של תערובת העיכול, זרוק אותו על שקופית זכוכית ובדוק אותו באמצעות מיקרוסקופ תרבית רקמות. לאחר 5-7 דקות של דגירה, רסיסי תולעים צריכים להיות מופחתים באופן ניכר לעין ואת slurry של תאים יהיה גלוי בקלות.
   10. עצור את התגובה עם 900 μL של מדיום L-15 קר זמין מסחרית של לייבוביץ' בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי של 50 U/mL פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין).
   11. גלולה בודדה שברים ותאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 x גרם ב 4 ° C. לשטוף את התאים גלולה עם 1 מ"ל של מדיה קרה בתוספת L-15 פעמיים נוספות כדי להבטיח כי עודפי פסולת וקוטיקולה מוסרים.
   12. יש להשהות מחדש תאים כדוריים ב-1 מ"ל של מדיה בתוספת L-15 ולהשאיר על קרח למשך 30 דקות. קח את השכבה העליונה, בערך 700-800 μL, לצינור מיקרוצנטריפוגה. שכבה זו מכילה תאים ללא פסולת תאים ותשמש לבידוד הבא של תאים מעניינים.
   13. בהתאם להוראות היצרן, השתמש במונה תאים אוטומטי או בהמוציטומטר כדי למדוד את צפיפות התאים של 10-25 מיקרוליטר של תאים מבודדים.

חומרים