קיבוע אתנול וצביעת DAPI: שיטה להמחשת DNA ב- C. elegans

תקציר

מקור: Clarke, E. K., et al. "מניפולציה של Ploidy ב Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

כאן אנו מתארים טכניקה המשמשת לדמיון דנ"א גנומי בנמטודות קבועות ושלמות. הסרטון כולל פרוטוקול לדוגמה לספירת כרומטין בביציות C. elegans לא מופרות.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

ניתן לאמת זנים טטרפלואידים על ידי ספירת מספר הכרומוזומים בביציות הלא מופרות שלהם. ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן את מספר זוגות הכרומוזומים בביציות דיפלואידיות לא מופרות (לפני החלוקות המיוטיות), אם לזן יש סמן פלואורסצנטי לכרומוזומים. בהיעדר סמנים כרומוזומים פלואורסצנטיים, ניתן לסנן נמטודות טטרפלואידיות על ידי קיבוע הנמטודות וצביעה בצבע DNA; ראה להלן פרוטוקול לקיבוע אתנול וצביעת בעלי חיים שלמים 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI).

צביעת DAPI של חיה שלמה

הערה: זני טטרפלואידים הנושאים 12 זוגות כרומוזומים מחוברים ניתנים לאימות על ידי צביעת DAPI של בעלי חיים אלה וספירת מספר גופי DAPI בביציות הלא מופרות שלהם.

1. מקם 5 עד 10 μL של חיץ M9 על שקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן להעביר 6 - 10 נמטודות לטיפה.
2. תחת מיקרוסקופ מנתח, שאבו את רוב ה-M9 מהטיפה מבלי להסיר את הנמטודות בעזרת רקמת ניקוי ללא מוך. לאחר מכן, מיד להוסיף טיפה 10 μL של 90% אתנול על התולעים. אפשרו לתולעים להתייבש לחלוטין, אך לא יותר מכמה שניות.
3. ברגע שהאתנול מתאדה (ניתן לראות זאת כפי שקורה במיקרוסקופ המנתח), הוסיפו 10 מיקרוליטר נוספים של 90% אתנול לתולעים.
4. חזור על שלב 3.1.3 שלוש פעמים נוספות.
5. לאחר שהטיפה האחרונה של אתנול התאדה, יש להוסיף 6 μL של צבע DAPI או Hoechst בריכוז הסופי המומלץ במצע ההרכבה המועדף (לדוגמה, דילול של 1:1,000 של ריכוז מלאי DAPI של 2 ננוגרם/מיקרוליטר ב-M9). לאחסון לטווח ארוך של המגלשות, ניתן להשתמש ב-0.5% p-פנילאנדיאמין מומס ב-20 מילימטר Tris-HCl, pH 8.8, ב-90% גליצרול כתמיסת אנטי-דהייה במקום M9 בלבד.
6. מכסים את התולעים במגלשה עם כיסוי ואוטמים את שולי הכיסוי עם לק. ציון במיקרוסקופ פלואורסצנטי (שלב 3.1.7) לפחות 10 דקות לאחר הוספת הכיסוי. שקופיות ללא antifade ניתן לאחסן במשך כמה ימים ב 4 ° C לפני ניקוד, אבל איכות פלואורסצנטיות מתחיל לרדת לאחר כמה ימים.
7. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 100, ניתן לדרג את מספר גופי DAPI בודדים (ככל הנראה זוגות כרומוזומים בודדים) בביצית הלא מופרית הבוגרת ביותר, הסמוכה מיד לזרע וטרם נכנסה לזרע או לרחם.
   1. כדי לדרג גופי DAPI בודדים בתוך גרעין ביצית, השתמש במיקוד העדין של המיקרוסקופ כדי לנוע באיטיות מראש גרעין הביצית לתחתית במהלך הספירה. לאחר מכן, ספרו מחדש את אותו גרעין תוך כדי הזזת המיקוד בכיוון ההפוך (כלומר, מלמטה לחלק העליון של הגרעין) כדי לאשר את המספר הנספר של גופי DAPI.
8. הניקוד את הביצית הלא מופרית הבוגרת ביותר בכל אחת משתי הגונדות בלפחות עשר הרמפרודיטים לכל זן לון יציב. לביציות מסוג בר יש 6 גופי DAPI בממוצע, 5 זוגות אוטוזומים, וזוג כרומוזומי מין. נוכחותם של 12 גופי DAPI בביצית של זני Lon יציבים מצביעה על כך שבעלי החיים בזן זה הם חלקיים (4 סטים של אוטוזומים, 3 כרומוזומי X) או שלמים (4 סטים של אוטוזומים, 4 כרומוזומי X).
9. חשב את המספר הממוצע של גופי DAPI שנצפו ממספר (לפחות 10) ביציות לכל זן. חלק מזוגות הכרומוזומים ייגעו זה בזה או יעמדו זה על גבי זה, כך שמספר גופי DAPI בביצית הוא לעתים קרובות קטן יותר מהמספר האמיתי של זוגות כרומוזומים.
10. (אופציונלי) אימות נוסף של זני Lon יציבים שבהם המספר הממוצע של גופי DAPI הוא 12 כדי לבדוק אם הם טטרפלואידים מלאים (4A, 4X) או חלקיים (4A, 3X) על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית כנגד חלבוני ציר כרומוזומים כגון HTP-3. צביעה זו תבחין בין זוגות כרומוזומים על ידי הצגת תבנית בצורת צלב מכרומוזומים בודדים שאינם מחוברים הנמצאים בטטרפלואיד החלקי.

חומרים

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="627"> רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה שם חברה מספר קטלוג הערות מיקרוסקופ מנתח Motic Microscopy SMZ171 Name חברה מספר קטלוגי הערות צביעה Hoechst 33258, Pentahydrate ביוטיום 40045 DAPI ביוטיום 40011 Name חברה מספר קטלוגי הערות קיבוע אתנול אתנול, טהור, 190 הוכחה (95%), USP Koptec, VWR 89125-166 Name חברה מספר קטלוגי הערות M9 Buffer נתרן כלורי, כיתה ביוטכנולוגית VWR 97061-278 אשלגן פוספט, מונובייסיק כיתה נטולת מים VWR 97062-346 נתרן פוספט, מונובייסיק דיהידראט פישר סיינטיפיק AC271750025