A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Kudumala, S., et al. שחייה גרמה לשיתוק כדי להעריך איתות דופמין ב- Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2019).

כאן, אנו מציגים בדיקה למדידת SWIP, פנוטיפ התנהגותי של C. elegans המתרחש במהלך תנועה נמרצת כמו שחייה. הפרוטוקול לדוגמה דן הן בגישות ניתוח ידניות והן בגישות ניתוח אוטומטיות.

Protocol

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Kudumala et al, Swimming Induced Parlicis to Assessment Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).

SWIP

הערה: אנו מתארים את השיטה הידנית להערכת SWIP בתולעים מסוג בר המטופלות ב- AMPH. אנו גם דנים בקצרה במעקב אחר תולעים וניתוח נוסף של קינטיקה של תולעים באמצעות גשש תולעים אוטומטי ותוכנת מעקב שתוארו בעבר על ידי Hardaway et al.

1. שיטה ידנית לבדיקת SWIP
   1. Aliquot 40 μL של 200 mOsm/L תמיסת סוכרוז עם או בלי 0.5 mM אמפר לתוך צלחת ספוט זכוכית. תחת הסטריאוסקופ, בוחרים 8-10 תולעים בשלב מאוחר L4 עם ריסים או פיק פלטינה וטובלים את הפיק בצלחת המכילה את התמיסה עד שהתולעים זזות מהפיק ושוחות לתוך התמיסה. שימו לב למספר התולעים שנקטפו לתוך הבאר, הפעילו את הטיימר, התבוננו ותיעדו את מספר התולעים המציגות SWIP בכל סימן דקה.
   2. העתק את הנתונים הגולמיים לגיליון אלקטרוני וחשב את אחוז התולעים המשותקות על ידי חלוקת מספר התולעים המשותקות בכל דקה במספר הכולל של התולעים שנבדקו לאורך הבדיקה והכפל ב- 100. העתק את ערכי האחוזים לכל תוכנת גרפים וסטטיסטיקה והתווה את הנתונים עם ערכי אחוזים על ציר Y וזמן על ציר X באמצעות תבנית תרשים XY.
   3. בצע ANOVA דו-כיווני ואחריו ניתוח פוסט-הוק (למשל, Bonferroni לאחר המבחן) כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית בקרב קבוצת הביקורת, קבוצות AMPH וזמן הטיפול.
2. ניתוח אוטומטי של SWIP
   1. בצע ניתוח אוטומטי על תולעת אחת בכל פעם. הפרוטוקול להגדרת המצלמה, תוכנת הגשש התולעת והסקריפט להפעלת ניתוח תוכנת המעקב מתוארים בפירוט ב- Hardaway et al.
   2. בקצרה, הניחו הרמפרודיט אחד מאוחר בשלב L4 לתוך צלחת ספוט זכוכית באמצעות פיק ריסים, כמתואר בשיטה הידנית בסעיף 1.1.2. הקלט סרטוני שחייה של תולעת אחת באותו זמן והשתמש בתוכנת גשש התולעים כדי לחשב את תדירות כפיפות הגוף.
   3. עקוב אחר הסקריפט שסופק עם תוכנת המעקב כדי להשיג תדירות חבטת תולעים וליצור מפות חום מנתוני חבטת התולעים.

Materials

Amphetamine	Sigma	51-63-8  
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/