הזנת RNAi בתרבית נוזלית: שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשמטת ביטוי גנים ב- C. elegans

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. תרבית נוזלית של בעלי חיים חסרי גונדה לאיסוף בעלי חיים צעירים וקשישים הנתונים ל-RNAi המכוון לגן מעניין

הערה: התגובה של גנים מסוימים ל-RNAi יכולה להיות תלוית טמפרטורה כפי שתואר קודם לכן. כחלופה ל-RNAi, גן מוטנטי יכול להיות משולב ברקע gon-2(-).

1. הכנת חיידקים לתרבית נוזלית
   1. הכינו חיידקי OP50 ו-RNAi (חיידקים המייצרים את ה-dsRNA הרצוי וחיידקים עם הווקטור הריק כבקרה) על ידי חיסון 4 L LB בינוני עם 12 מ"ל של תרבית החיידקים המתאימה (הוסיפו ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-1 מילימטר IPTG לתרביות חיידקי RNAi) ודגרו עליהם ב-37°C למשך הלילה ב-180 סל"ד.
   2. למחרת קצרו את התרביות בטמפרטורה של 6,700 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. הסירו את הסופרנאטנטים והשהו מחדש כל גלולה במצע בסיסי S קר כקרח של 60 מ"ל (100 mM NaCl, 50 mM אשלגן פוספט pH 6, נשמר על קרח). שמור את שלושת הכדוריות המרחפות מחדש (OP50, חיידקי RNAi בקרה, וחיידקי RNAi עבור הגן המעניין) ב 4 ° C עד שלב 1.2.
      NOTE: ניתן לגדל תולעים על RNAi משלב L1 או כדי למנוע פגמים התפתחותיים משלב הזחל האחרון L4 (ראה שלב 1.2).
2. תרבית נוזלית לטיפול ב-RNAi החל משלב הזחל האחרון L4
   1. הוסף 200 מ"ל S מדיה בסיסית בבקבוק תרבית פרנבך (קיבולת 2,800 מ"ל). לקבלת נפח תרבית סופי של 300 מ"ל (ראה 1.2.2.4), הוסף 10 mM אשלגן ציטראט, pH 6, 3 מ"ל תמיסת מתכות קורט (5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 2.5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0.1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL carbendazim, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל כולסטרול). סגור את הבקבוק עם מכסה בורג הממברנה. עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של חוצצים.
   2. קח את L1s מתוך 25 ° C ולהעביר אותם צינורות 15 מ"ל. צנטריפוגה בגודל 1,900 x גרם למשך 3 דקות, הסירו את הסופרנטנט וספרו את ה-L1s ל-2 מיקרוליטר. הוסיפו 500,000 L1s לבקבוק תרבית פרנבאך שהוכן בשלב הקודם.
   3. הוסף OP50 (משלב 1.1) באופן יחסי למספר התולעים. לדוגמה, עבור 500,000 תולעים להוסיף 60 מ"ל OP50.
   4. תרבית תולעים מלאה עם S בזאלית כדי להביא את הנפח הכולל ל 300 מ"ל. דוגרים על תרבית התולעים עד שלב L4 ב-25 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-150 סל"ד.
   5. למחרת, התולעים צריכות להיות בגודל של L4s מסוג פראי. כדי לעבור מחיידקי OP50 לחיידקי RNAi, אספו בעלי חיים בשש צינוריות של 50 מ"ל, הניחו להם לשקוע והסירו את הסופרנטנט. שטפו את ה-L4s עם M9 כדי להסיר שאריות חיידקי OP50: צנטריפוגה ב-1900 x גרם למשך 3 דקות, הסירו את הסופרנאטנט והעבירו את כל ה-L4s לצינור אחד של 50 מ"ל. ספרו את L4s לכל 5 μL (לפחות תשע פעמים). פעמיים דרושים 50,000 L4 לאיסוף התולעים הצעירות ופעמיים 100,000 L4 לאיסוף התולעים המיושנות.
   6. הכינו ארבע צלוחיות תרבית פרנבך כמתואר ב-1.2.2.1. הוסף גם ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-1 מ"מ IPTG לכל בקבוק.
   7. הוסף חיידקי RNAi בקרה וחיידקי RNAi עבור הגן המעניין (משלב 1.1) באופן יחסי למספר התולעים: הוסף 7 מ"ל של החיידקים המתאימים לכל בקבוק עבור תולעים צעירות ו 14 מ"ל לכל בקבוק עבור התולעים הזקנות.
   8. הוסף 50,000 תולעים לבקבוק לאוסף התולעים הצעירות ו -100,000 תולעים לבקבוק לאוסף התולעים המיושנות, והשלם את התרביות עם S בזאלי כדי למלא עד 300 מ"ל. לדגור על תרביות התולעים (ארבע בסך הכל) ב 25 ° C ו 150 סל"ד.

2. תחזוקת תרביות נוזליות של C. elegans

1. מעת לעת לאסוף aliquot מכל תרבית נוזלית ולהניח על מגלשת זכוכית (לחלופין על צלחת אגר) כדי לוודא שאין זיהום. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה בודקים את רמות המזון החיידקי בתרבית במיוחד בשלב הגדילה. הכינו מראש 2 תרביות L של חיידקי RNAi בקרה וחיידקי RNAi לגן המעניין כמתואר בשלב 1.1. הוסיפו אותם לתרביות נוזליות של C. elegans במידת הצורך ושמרו את השאר על 4°C.
2. מעת לעת לבדוק כי בעלי החיים הם סטריליים. לרוב בעלי החיים לא תהיה גונדה. בהתאם לחדירה של מוטציית gon-2, חלקם עשויים להפיל מבנים גונדל אבל אין לראות בעלי חיים עם ביצים.

טבלה 1.