הזנת RNAi בתרבית נוזלית: שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשמטת ביטוי גנים ב- C. elegans

תקציר

מקור: Groh, N. et al. שיטות לחקר שינויים בצבירת חלבונים אינהרנטית עם הגיל ב- Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi הוא כלי גנטי רב עוצמה הזמין לחוקרי C. elegans. סרטון זה מציג שיטה לטיפול ביותר תולעים עם RNAi מאשר הזנת צלחות על ידי ניצול תנאי תרבית נוזלית.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. תרבית נוזלית של בעלי חיים חסרי גונדה לאיסוף בעלי חיים צעירים וקשישים הנתונים ל-RNAi המכוון לגן מעניין

הערה: התגובה של גנים מסוימים ל-RNAi יכולה להיות תלוית טמפרטורה כפי שתואר קודם לכן. כחלופה ל-RNAi, גן מוטנטי יכול להיות משולב ברקע gon-2(-).

1. הכנת חיידקים לתרבית נוזלית
   1. הכינו חיידקי OP50 ו-RNAi (חיידקים המייצרים את ה-dsRNA הרצוי וחיידקים עם הווקטור הריק כבקרה) על ידי חיסון 4 L LB בינוני עם 12 מ"ל של תרבית החיידקים המתאימה (הוסיפו ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-1 מילימטר IPTG לתרביות חיידקי RNAi) ודגרו עליהם ב-37°C למשך הלילה ב-180 סל"ד.
   2. למחרת קצרו את התרביות בטמפרטורה של 6,700 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. הסירו את הסופרנאטנטים והשהו מחדש כל גלולה במצע בסיסי S קר כקרח של 60 מ"ל (100 mM NaCl, 50 mM אשלגן פוספט pH 6, נשמר על קרח). שמור את שלושת הכדוריות המרחפות מחדש (OP50, חיידקי RNAi בקרה, וחיידקי RNAi עבור הגן המעניין) ב 4 ° C עד שלב 1.2.
      NOTE: ניתן לגדל תולעים על RNAi משלב L1 או כדי למנוע פגמים התפתחותיים משלב הזחל האחרון L4 (ראה שלב 1.2).
2. תרבית נוזלית לטיפול ב-RNAi החל משלב הזחל האחרון L4
   1. הוסף 200 מ"ל S מדיה בסיסית בבקבוק תרבית פרנבך (קיבולת 2,800 מ"ל). לקבלת נפח תרבית סופי של 300 מ"ל (ראה 1.2.2.4), הוסף 10 mM אשלגן ציטראט, pH 6, 3 מ"ל תמיסת מתכות קורט (5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 2.5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0.1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL carbendazim, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל כולסטרול). סגור את הבקבוק עם מכסה בורג הממברנה. עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של חוצצים.
   2. קח את L1s מתוך 25 ° C ולהעביר אותם צינורות 15 מ"ל. צנטריפוגה בגודל 1,900 x גרם למשך 3 דקות, הסירו את הסופרנטנט וספרו את ה-L1s ל-2 מיקרוליטר. הוסיפו 500,000 L1s לבקבוק תרבית פרנבאך שהוכן בשלב הקודם.
   3. הוסף OP50 (משלב 1.1) באופן יחסי למספר התולעים. לדוגמה, עבור 500,000 תולעים להוסיף 60 מ"ל OP50.
   4. תרבית תולעים מלאה עם S בזאלית כדי להביא את הנפח הכולל ל 300 מ"ל. דוגרים על תרבית התולעים עד שלב L4 ב-25 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-150 סל"ד.
   5. למחרת, התולעים צריכות להיות בגודל של L4s מסוג פראי. כדי לעבור מחיידקי OP50 לחיידקי RNAi, אספו בעלי חיים בשש צינוריות של 50 מ"ל, הניחו להם לשקוע והסירו את הסופרנטנט. שטפו את ה-L4s עם M9 כדי להסיר שאריות חיידקי OP50: צנטריפוגה ב-1900 x גרם למשך 3 דקות, הסירו את הסופרנאטנט והעבירו את כל ה-L4s לצינור אחד של 50 מ"ל. ספרו את L4s לכל 5 μL (לפחות תשע פעמים). פעמיים דרושים 50,000 L4 לאיסוף התולעים הצעירות ופעמיים 100,000 L4 לאיסוף התולעים המיושנות.
   6. הכינו ארבע צלוחיות תרבית פרנבך כמתואר ב-1.2.2.1. הוסף גם ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-1 מ"מ IPTG לכל בקבוק.
   7. הוסף חיידקי RNAi בקרה וחיידקי RNAi עבור הגן המעניין (משלב 1.1) באופן יחסי למספר התולעים: הוסף 7 מ"ל של החיידקים המתאימים לכל בקבוק עבור תולעים צעירות ו 14 מ"ל לכל בקבוק עבור התולעים הזקנות.
   8. הוסף 50,000 תולעים לבקבוק לאוסף התולעים הצעירות ו -100,000 תולעים לבקבוק לאוסף התולעים המיושנות, והשלם את התרביות עם S בזאלי כדי למלא עד 300 מ"ל. לדגור על תרביות התולעים (ארבע בסך הכל) ב 25 ° C ו 150 סל"ד.

2. תחזוקת תרביות נוזליות של C. elegans

1. מעת לעת לאסוף aliquot מכל תרבית נוזלית ולהניח על מגלשת זכוכית (לחלופין על צלחת אגר) כדי לוודא שאין זיהום. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה בודקים את רמות המזון החיידקי בתרבית במיוחד בשלב הגדילה. הכינו מראש 2 תרביות L של חיידקי RNAi בקרה וחיידקי RNAi לגן המעניין כמתואר בשלב 1.1. הוסיפו אותם לתרביות נוזליות של C. elegans במידת הצורך ושמרו את השאר על 4°C.
2. מעת לעת לבדוק כי בעלי החיים הם סטריליים. לרוב בעלי החיים לא תהיה גונדה. בהתאם לחדירה של מוטציית gon-2, חלקם עשויים להפיל מבנים גונדל אבל אין לראות בעלי חיים עם ביצים.

פתרון מלאי	כמות	ריכוז סופי	הערות/תיאור
S בסיסי (עבור 500 מ"ל: 5.9 גרם NaCl, 50 מ"ל 1 M אשלגן פוספט pH 6)	200 מ"ל		1 M אשלגן פוספט pH 6: עבור 1 L: 129 גרם KH2PO4 monobasic, 52 גרם K2HPO4 דו-בסיסי נטול מים
1 M אשלגן ציטראט pH 6 (עבור 400 מ"ל: 13.1 גרם מונוהידרט חומצת לימון, 134.4 גרם טרי-אשלגן ציטראט מונוהידראט)	3 מ"ל	10 מ"מ
תמיסת עקבות מתכות (עבור 1 ליטר: 1.86 גרם חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA), 0.69 גרם FeSO4 · 7 H2O, 0.2 גרם MnCl2 · 4 H2O, 0.29 גרם ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 גרם CuSO4 · 5 H2O)	3 מ"ל		אחסנו את תמיסת המלאי בחושך בטמפרטורה של 4°C
1 M MgSO4 (עבור 500 מ"ל: 123.3 גרם)	900 מיקרוליטר	3 מ"מ
1 מטר CaCl2 (עבור 500 מ"ל : 73.5 גרם)	900 מיקרוליטר	3 מ"מ
200 מיקרוגרם/מ"ל Carbendazim (עבור 50 מ"ל: 10 מ"ג מתנול)	150 מיקרוליטר	100 ננוגרם/מ"ל
5 מ"ג/מ"ל כולסטרול (עבור 100 מ"ל: 0.5 גרם אתנול)	300 μL	5 מיקרוגרם/מ"ל

טבלה 1.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוק תרבות פרנבך	קורנינג	4425-2XL	Pyrex, קיבולת 2,800 מ"ל, עם 3 כניסות baffle	כן
מכסה בורג ממברנה	שוט	1E+06	GL45	כן
מיקסר מזין	VWR	444-0148		כן
משפך מפריד	נלג'ין	4300-1000	תכולה: 1,000 מ"ל	לא
1 מ"ל מזרק	BD פלסטיפק	3E+05		לא
מחט אפורה, 27 G x 1/2 אינצ', 0.4 מ"מ x 13 מ"מ	BD מיקרולנס 3	3E+05		לא
מסנני ממברנה 0.025 מיקרומטר	מיליפור	VSWP04700		לא
רצועת pH	מצ'רי-נגל	92110	pH-תיקון 0-14	לא
קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	5E+09	טבליות Mini EDTA שלמות	לא
אוקוקסינול-9	אפליכם	A1388	טריטון X-100	לא
4-חומצה מורפולינית-סולפונית (MES)	סיגמא-אולדריץ'	M1317		לא
נונילפנילפוליאתילן גליקול	אפליכם	A1694	נונידט P40 (NP40)	לא
DNaseI	רוש	5E+09	רקומביננטי, ללא RNase	לא
RNaseA	פרומגה	A7973	תמיסה	לא
סה"כ כתמים חלבונים	תרמופישר	S11791	כתם חלבון Sypro Ruby	לא
סה"כ צביעת ג'ל חלבון	תרמופישר	S12001	כתם ג'ל חלבון Sypro Ruby	לא
TCEP (תריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד)	סרווה	36970		לא
יודואצטמיד	סרווה	26710		לא
אמוניומביקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	9830		לא
טריפסין מעובד בדרגת ריצוף	פרומגה	V5111		לא
תגים איזובריים לכימות יחסי ומוחלט	סייקס	4E+06	ערכת מולטיפלקס ריאגנטים iTRAQ	לא
צנטריפוגה Avanti J-26XP	בקמן קולטר	4E+05		כן
אולטרה-צנטריפוגה Optima Max-XP	בקמן קולטר	4E+05		לא
צנטריפוגה 5424R	אפנדורף	5E+09		כן
צנטריפוגה 5702	אפנדורף	6E+09		כן
צנטריפוגה Megafuge 40R	תרמו סיינטיפיק	8E+07		לא
רכז פלוס	אפנדורף	5E+09	מאייד צנטריפוגלי	לא
מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי M165 FC	לייקה		עם המטרה Planapo 2.0x	לא
מיקרוסקופ דיסקציה	לייקה		Leica S6E	כן
מיקרוסקופ בהגדלה גבוהה Zeiss Axio Observer Z1	זיס		עם PlanAPOCHROMAT 20x objective ו- Zeiss Axio Cam MRm	לא
תוכנה				לא
תוכנה לניתוח תמונות	ImageJ			לא
ניתוח נתוני ספקטרומטריית מסות	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	לא
זני E.coli
OP50	CGC
חיידקי RNAi
L4440	Julie Ahringer ספריית RNAi
C. elegans מוטנטים
CF2253	CGC, שם הזן: EJ1158		גנוטיפ: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	המעבדה של דלה דוד ב-DZNE Tübingen		גנוטיפ: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	המעבדה של דלה דוד ב-DZNE Tübingen		גנוטיפ: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]