ג. אלגנס דיסקציה של בלסטומיר: שיטה להסרת קליפת הביצה ולניתוק תאים עובריים

תקציר

מקור: Hsu, C. R., et al. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans, Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beadsive.J. Vis. Exp.(2019).

סרטון זה מציג שיטה לבידוד בלסטומרים של C. elegans מעוברים מוקדמים. התאים המתקבלים מתאימים לתרבית תאים או לניסויים ex vivo.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Hsu et al, In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp.(2019).

1. בידוד של בלסטומר עובר
2. יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה כדי למנוע חיתוך ומגע עם תמיסת ההלבנה.
   1. החזק כל קצה של מיקרו-נימי (קיבולת; 10 μL) ביד ימין ושמאל.
   2. משכו את המיקרו-נימים לכיוון שני הקצוות כדי להפעיל מתח, והביאו את מרכז הנימים מעל מבער כדי ליצור שני נימים שנמשכו ביד (איור 1A).
   3. חותכים את קצות הנימים שנמשכים ביד עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ המנתח ומחברים את הנימים המשוכים למנגנון פיטום פה. הכינו שני סוגים של פיפטות (פיפטה). גודל פתח הקצה של הפיפטות צריך להיות בערך פי 2 ופי 1 מאורך הציר הקצר של עוברי C. elegans (30 מיקרומטר) להחזרת עוברים והוצאת קליפת ביצית, בהתאמה איור 1B-D).
   4. פיפטה 45 מיקרוליטר של תמיסת מלח ביצים על באר של מגלשה מרובת בארות (איור 2A; למטה).
   5. מניחים 5-10 C. elegans בוגרים על באר המכילה תמיסת מלח ביצים.
   6. כדי להשיג עוברים מוקדמים של C. elegans, חתכו את הבוגרים לחתיכות על-ידי מיקום שתי מחטים מימין ומשמאל לגוף C. elegans והחלקת המחטים זו על פני זו (איור 2A; סכמות עליונות).
   7. פיפטה 45 מיקרוליטר של תמיסת היפוכלוריט על באר ליד הבאר המכילה תמיסת מלח ביצים (איור 2B).
   8. פיפטה 45 μL של מצע הגידול של שלטון על שלוש הבארות הבאות ליד הבאר המכילה תמיסת היפוכלוריט (איור 2B).
   9. העבירו עוברים בשלב 1 של תאים ובשלב מוקדם של 2 תאים לתמיסת היפוכלוריט באמצעות פיפטציה דרך הפה עם הנימים המצוירים ביד לצורך החזרת עוברים (איור 2B).
   10. חכו 40–55 שניות.
   11. שטפו את העוברים על-ידי העברת העוברים מתמיסת היפוכלוריט למדיום הגדילה של שלטון על-ידי פיטום דרך הפה עם הנימים המצוירים ביד לצורך החזרת עוברים (איור 2B).
   12. שטפו את העוברים שוב על-ידי העברת העוברים לבאר חדשה של מצע הגדילה של שלטון על-ידי פיטום דרך הפה עם הנימים המצוירים ביד לצורך החזרת עוברים (איור 2B).
   13. מעבירים את העוברים השטופים לבאר חדשה של מדיום הצמיחה של שלטון על ידי פיטום דרך הפה עם הנימים המצוירים ביד להחזרת העוברים. בעזרת הנימים המשורטטים ביד להסרת קליפות ביצים, חזרו בזהירות על הפיפטינג (איור 2C; סכמות אמצעיות). אם קליפת הביצה מוסרת בהצלחה, התאים העובריים יהפכו לכדוריים יותר (איור 2C; מימין).
   14. הפרידו את הבלסטומרים העובריים בשלב 2 התאים על-ידי פיפטוף עדין ומתמשך עם הנימים המצוירים ביד להסרת קליפת הביצה (איור 2D).

איור 1: בידוד בלסטומירים.(A) משיכה ידנית של נימי זכוכית. (B) נימי זכוכית מצוירים ביד להחזרת עוברים. (C) נימי זכוכית מצוירים ביד להסרת קליפות ביצים. (D) סכמות המראות את הגודל המתאים של פתח נימי להסרת קליפת הביצה. חצים מציינים עוברים. פסי קנה מידה מראים 100 מיקרומטר.

איור 2: זרימת עבודה של בידוד Blastomere.(A) דיסקציה של C. elegans בוגרים במאגר מלח ביצים כדי להשיג עוברים. צילומים מראים עוברים בשלב 2 תאים ו -4 תאים לפני הסרת קליפת ביצית. (B) טיפול ושטיפה בהיפוכלוריט. (C) סכמות מתארות את העיתוי המתאים להסרת קליפות ביצים. בתצלום נראה עובר בן 4 תאים לאחר הסרת קליפת ביצית. (ד) הפרדת בלסטומירים. בתצלום נראה עובר מופרד בן 2 תאים. גודלי החצים ב-C וב-D מציינים את הכוחות היחסיים הנדרשים במהלך הפיפט. פסי קנה מידה מראים 50 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכלול צינור שאיפה	דראמונד	לבידוד הבלסטומרי.
זן Caenorhabditis elegans: N2, סוג בר	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis	N2	הזן ששימש במחקר זה
זן Caenorhabditis elegans: KSG5, גנוטיפ: zuIs45; itIs37	בבית	KSG5	הזן ששימש במחקר זה
Mircopipets מכויל 10 μL	דראמונד	21-180-13	לבידוד הבלסטומרים
CD תרכיז שומנים	לייף טכנולוגיות	11905031	לבידוד הבלסטומרי. עבודה בתרבית הרקמה.
קלורוקס	קלורוקס	נ. א.	לבידוד הבלסטומרי. פתח בקבוק חדש כאשר הטיפול hypochlorite לא עובד טוב.
מחזיק כיסוי	בבית	נ.א.	לבידוד הבלסטומרי.
מיקרוסקופ ניתוח: Zeiss Stemi 508 עם מעמד M. מקור האור הוא LED מובנה. הגדלת העין היא פי 10.	קרל זיס	סטמי 508	לבידוד הבלסטומרי.
סרום בקר עוברי, Qualified One Shot, מקור קנדה	גיבקו	A3160701	לבידוד הבלסטומרי. עבודה בתרבית הרקמה.
שימוש כללי ומחטים היפודרמיות מדויקות לגלישה, 25 מד	ב.ד.	14-826AA	לבידוד הבלסטומרים
אינולין	אלפא עזר	AAA1842509	לבידוד הבלסטומרים
MEM (100x)	גיבקו	11120052	לבידוד הבלסטומרי.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	לבידוד הבלסטומרים
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	גיבקו	15140148	לבידוד הבלסטומרי.
פוליוויניל פירולידון	פישר ביוריאגנטים	BP431-100	לבידוד הבלסטומרים
אשלגן כלורי	ביושופ	POC888	לבידוד הבלסטומרים
המדיום הסטרילי דרוזופילה של שניידר	גיבקו	21720024	לבידוד הבלסטומרי. עבודה בתרבית הרקמה.
נתרן כלורי	ביושופ	SOD001	לבידוד הבלסטומרים
תמיסת נתרן הידרוקסידי, 10 N	פישר כימיקלים	SS255-1	לבידוד הבלסטומרים
מסנני מזרק, PTFE, לא סטרילי	בסיקס	13100115	לבידוד הבלסטומרי.
צינורות מעבדה Tygon S3,, נוסחה E-3603, קוטר פנימי 3.175 מ"מ	Saint Gobain Performance פלסטיק	89403-862	לבידוד הבלסטומרי.
Tygon S3,, נוסחה E-3603, קוטר פנימי 6.35 מ"מ	Saint Gobain Performance פלסטיק	89403-854	לבידוד הבלסטומרי.

<טד >21-180-13 תמיסת ויטמין צינורות מעבדה