הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

תקציר

מקור: Turek, M. et al. Agarose Microchambers להדמיית סידן ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp.(2015).

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. הדמיית סידן

1. השתמש בזנים טרנסגניים המבטאים חיישני סידן מקודדים גנטית כגון HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
2. השתמש במיקרוסקופ מורכב המצויד עבור epifluorescence שדה רחב. חבר את פלט ה-TTL של מצלמת ה-EMCCD לקלט ה-TTL של נורית ה-LED, כך שבכל פעם שהמצלמה תקליט פריים, הדגימה תהיה מוארת. יש להשתמש בזמן חשיפה של כ-5 מילישניות. השתמש ברווח EM בטווח של 50 - 300.
3. ציין סרט רצף שרץ במשך 24 שעות כאשר כל תולעת מצולמת כל 15 - 30 דקות תחילה למשך 20 שניות עם DIC, לאחר מכן במשך 20 שניות עם פלואורסצנטיות GFP כדי להקליט GCaMP, ולאחר מכן צלם תמונה סופית של אות mKate2 נלקח כדי לשלוט ברמות הביטוי. השתמש בקצב פריימים של 2/sec במהלך כל רצף מהיר.
4. לבדיקת נתונים חזותיים, השתמש במפת צבע כוזב כדי לשפר את הנראות של שינויים קטנים בעוצמת הפלואורסצנטיות. התווה נתונים פלואורסצנטיים כ- ΔF/F, כאשר F הוא הערך הבסיסי הממוצע של פלואורסצנטיות. תיאור מפורט של ניתוח נתוני סידן ניתן למצוא בספרות.

חומרים

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="749"> רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה שם חברה מספר קטלוג הערות מערכת LED CoolLED pE-2 מיקרוסקופ מורכב ניקון קשר EMCCD camera אנדור iXon 897 נמכר כעת כ-iXon Ultra 897 Z-stage למיקרוסקופ לפני ננו סריקה Z X-Y שלב למיקרוסקופ לפני פרוסקאן השלישי מסנן אור אדום כרומה ET660/50m 35 מ"מ צלחת פטרי בז צלחות פטרי חד פעמיות בז, סטריליות, קורנינג