$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה מובא מתוך Teoh et al, גישות כמותיות לחקר מבנים תאיים ומורפולוגיה של אברונים ב- Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. כימות מבנה שרירי דופן הגוף
- הדמיה פלואורסצנטית של מבנה שריר דופן הגוף
- השג זן (לדוגמה, RW1596) הנושא את הטרנסגן stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))), המסמן סיבי מיוזין עם GFP.
NOTE: החדרת הטרנסגן לבעלי חיים יכולה להיות מושגת על ידי חציית זן של עניין עם בעלי חיים שכבר מבטאים את הטרנסגן, או הזרקה זעירה של DNA לתוך הזרוע הדיסטלית של הגונדה. הפנוטיפ ה"מתגלגל" המושרה על ידי מוטציית רול-6 בטרנסגן זה מאפשר הדמיה של השרירים. שרירי דופן הגוף פועלים לאורך הצד הגבי והגחוני שבדרך כלל מנועים מהעין אצל חיות בר מכיוון שהם בדרך כלל שוכבים על אחד הצדדים הצדיים שלהם. אלל רול-6(su1006) גורם לפיתול של בעלי החיים, ובכך חושף חלק מתאי השרירים לצורך הדמיה.
- דמיינו את בעלי החיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם מצלמת מכשיר מצומד טעון ברזולוציה גבוהה (CCD), 40X אובייקטיבי ומעלה, מסנן GFP ותוכנת רכישה.
- התאימו את זמן החשיפה ואת עוצמת ההארה כדי למנוע תמונות רוויות מדי.
- לכוד ושמור תמונות של שרירים (הגדלה של 400X) מחלק של החיה המכיל לפחות תא שריר אלכסוני גלוי אחד לפחות. הימנע מאזורים עם תא שריר יחיד שאינו שלם או מקטעים שאינם ממוקדים. כמו כן, אין לכלול תמונות מאזורים קדמיים ואחוריים קיצוניים, ומאזורים הסמוכים לפות.
NOTE: אם לבעל החיים אין תא שריר שלם אחד הנראה לעין, החליקו בעדינות את הכיסוי כדי לסובב את החיה כך שתחשוף תא שלם.
- מדידת שטח תאי השריר
- פתח את התמונה בתוכנת פיג'י (גרסה 2.0.0 שימשה במחקר זה).
- השתמש בבחירת המצולע כדי לעקוב בזהירות סביב תא שריר אלכסוני יחיד. התאם את קו המצולע בסוף על-ידי גרירת נקודת העיגון לשיפור העקיבה.
- עבור אל הכרטיסייה ניתוח בחלק העליון של התוכנה ולחץ על מדידה כדי לחשב את שטח הבחירה. תוצג טבלת תוצאות נפרדת המכילה את השטח ומדידות אחרות. אם מדידת האזור חסרה בטבלת התוצאות, עבור אל הגדר מדידות תחת הכרטיסיה נתח ובדוק שתיבת האזור מסומנת. כמו כן, בטל את הסימון של מדידות אחרות שאינן נחוצות.
- לתאי שריר עם אזור מנוון/חסר, עקבו אחר האזור החסר בעזרת הכלי בחירת מצולע ולחצו שוב על 'מדידה'. אם קיימים רווחים מרובים בתוך התא, עקוב אחר כל רווח בנפרד.
- חשב את היחס בין שטח הפער לתא השריר היחיד כולו. יחס גבוה מצביע על רמה גבוהה יותר של ניוון שרירים עקב פערים גדולים בתוך התא. אם אין אזורים חסרים, כפי שנראה בדרך כלל אצל חיות בר, היחס יחושב כאפס.
NOTE: כביקורת, הניקוד גם עבור פגמים במבנה השריר באופן חזותי והשווה את התוצאות עם המדידה הכמותית. זה שימושי במיוחד אם הזן נחקר בפעם הראשונה במעבדה. עבור ניקוד פנוטיפי, להעריך את בעלי החיים כמו פגום או לא פגום בהתבסס על שלמות החוטים. לדוגמה, בעלי חיים עם אובדן פסיעות חוטים ברורות, גושי GFP, או רווחים בתוך תאי שריר עקב התמוטטות מבנית, יקבלו ציון כפגומים.