פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Xu and Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).
1. פציעה בלייזר
הערה: השתמש בהקרנת לייזר femtosecond (800 ננומטר) כדי לבצע פציעה מדויקת יותר.
- הכינו רפידות אגר על מגלשת זכוכית עם אגר 2% מומס. ודא שהרפידות דומות לרפידות האגר המשמשות להדמיה חיה של C. elegans.
- מעבירים 10 תולעים צעירות על פד האגרוז עם קוטף תולעים, ומוסיפים טיפה של 2 מיקרוליטר של תמיסת לבמיסול 12 מ"מ. מכסים את בעלי החיים ואת הנוזל בחלקת כיסוי. המתינו 1-2 דקות עד שהתולעים ישתקו.
- הניחו את שקופית הזכוכית על דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי. הזיזו את השלב כדי למצוא את התולעים והתמקדו באפידרמיס הסינציאלי הקדמי או האחורי עם מטרה של 100X (NA 1.4-1.46).
- הגדר את עוצמת לייזר הפמטו-שנייה ל- 140 mW (נמדד לפני המטרה). השתמש בלייזר פמטו-שניות בקצב חזרה של 80 MHz.
NOTE: שתי פעימות של 200 מילישניות כל אחת (מופרדות ב-20 מילישנייה) מספיקות לפציעה בידינו.
- התמקדו במשטח האפי של תא האפידרמיס ופצעו את האפידרמיס. שימו לב להפרעה מקומית של הציטופלסמה (מבעבע), או הלבנה מקומית של כל סמן פלואורסצנטי שנעשה בו שימוש.
NOTE: בצע את נהלי בטיחות הלייזר המתאימים בעת השימוש בלייזר פמטו-שניות. סריקות קו או נקודה באמצעות לייזר פמטו-שניות, כגון אלה בשני מיקרוסקופ פוטונים, אמורות לספק עוצמה מספקת לפציעות לייזר.
NOTE: אמנם אין לנו ניסיון ישיר בשימוש בלייזרים אחרים, אך באופן עקרוני פציעה צריכה להיות אפשרית באמצעות לייזרים UV קונבנציונליים (כפי שנעשה שימוש ב- C. elegans cell ablations). לחלופין, השתמש במודול Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) על קונפוקל דיסק מסתובב כדי לפצוע את האפידרמיס (N. Pujol, תקשורת אישית).
