האכלת FITC-Dextran: שיטה לכימות חדירות המעי ב- C. elegans

תקציר

מקור: Le, T. A. N., et al. מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מציג שיטה לדמיין ולמדוד את שלמות לומן המעי של C. elegans על ידי הזנת תולעים שכותרתן דקסטרן FITC. הפרוטוקול לדוגמה מציג את הבדיקה שנעשתה עם תולעים 3,3'-diindolylmethane (DIM) שטופלו וניזונו מפתוגן.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Le et al, מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. הכנת לוחות NGM לבדיקת ההשפעות של כימיקל (DIM) על חדירות המעי של C. elegans המוזנים עם P. aeruginosa
   1. הוסף 0.5 גרם פפטון, 0.6 גרם NaCl, 195 מ"ל מים מזוקקים, מערבל מגנטי ו 6.8 גרם אגר לבקבוק זכוכית 500 מ"ל (אגר NGM).
   2. הוסיפו 0.5 גרם פפטון, 0.6 גרם NaCl, 195 מ"ל מים מזוקקים ובוחש מגנטי ללא אגר לבקבוק זכוכית נוסף בנפח 500 מ"ל (ציר NGM).
   3. הוציאו את שני הבקבוקים (משלבים 1.1-1.2), בקבוק זכוכית אחד ריק של 100 מ"ל, ובקבוק זכוכית ריק אחד של 500 מ"ל למשך 15 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאפשר את המדיום המכיל בקבוקים להתקרר ל 55 ° C באמבט המים במשך 30 דקות. שמור את מדיום האגר באמבט המים והסר את הבקבוק המכיל מרק (משלב 1.2) לשלב הבא.
   4. הוסף את הכימיקלים המוספים למרק NGM: 0.4 מ"ל של 1 M CaCl₂, 0.4 מ"ל כולסטרול באתנול (מ"ל), 0.4 מ"ל של 1 M MgSO₄ ו 10 מ"ל של 1 M KPO₄ (כל המרכיבים הללו חייבים להיות מעוקרים מלבד הכולסטרול באתנול). לאחר מכן, ערבבו היטב את התערובת עם מערבל מגנטי בטמפרטורה של 55°C.
   5. תייגו את בקבוק הזכוכית הריק האוטומטי של 500 מ"ל עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ואת בקבוק הזכוכית הריק של 100 מ"ל עם DIM.
   6. העבירו 50 מ"ל של ציר גז טבעי נוזלי לבקבוק 100 מ"ל המסומן ב-DIM. הוסף 500 μL של ציר 20 mM DIM לבקבוק וערבב היטב.
      הערה: DIM מומס ב-DMSO (מלאי DIM של 20 mM).
   7. הסר במהירות את מדיום האגר NGM מאמבט המים, הוסף 50 מ"ל של מדיום אגר NGM לבקבוק המסומן ב- DIM וערבב היטב.
   8. הניחו אליציטוט של 20 מ"ל של מדיום NGM המכיל DIM בכל צלחת פטרי בגודל 90 מ"מ x 15 מ"מ. ניתן לייצר כחמש לוחיות NGM המכילות DIM משלב זה.
      הערה: הריכוז הסופי של DIM בכל צלחת NGM יהיה 100 μM.
   9. להכנת צלחת NGM המכילה DMSO, העבירו 150 מ"ל של ציר NGM לבקבוק 500 מ"ל המסומן ב-DMSO. מוסיפים 1.5 מ"ל DMSO לבקבוק ומערבבים היטב.
   10. הוסיפו 150 מ"ל של מדיום אגר NGM לבקבוק המסומן ב-DMSO וערבבו היטב.
   11. הניחו אליציטוט של 20 מ"ל של מדיום NGM המכיל DMSO בכל צלחת פטרי בגודל 90 מ"מ x 15 מ"מ. ניתן לייצר כחמש עשרה לוחות NGM המכילים DMSO משלב זה.
       הערה: הריכוז הסופי של DMSO בכל צלחת NGM יהיה 0.5%.
   12. מצקו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות לפחות ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
       NOTE: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   13. הסר את תרבית E. coli OP50 או P. aeruginosa PAO1 מהמקרר בטמפרטורה 4°C ומערבל את התרבית כראוי לפני התפשטות על לוחות NGM.
   14. שים 800 μL של תרבית חיידקי E. coli OP50 או P. aeruginosa PAO1 על כל צלחת אגר NGM טרי ולאפשר לצלחות להתייבש באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
       NOTE: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. עבור הניסוי השלישי (איור 1) הוכנו שתי לוחיות NGM המכילות DMSO מצופות ב-E. coli OP50 חי, צלחת NGM אחת המכילה DMSO מצופה ב-P. aeruginosa PAO1 חי, וצלחת NGM אחת המכילה DIM המצופה ב-P. aeruginosa PAO1 חי.
2. טיפול בחיידקים או DIM והזנת FITC-דקסטרן
   1. יש לדגור על ביצים מסונכרנות גיל בטמפרטורה של 20°C למשך 64 שעות על צלחות NGM בתוספת E. coli OP50 חי כמזון.
   2. שטפו את זחלי L4 המסונכרנים לגיל עם חיץ S והעבירו אותם (יותר מכ-500 תולעים) לצלחות טיפול NGM המכילות חיידקים וכימיקלים שונים. לדגור אותם ב 20 ° C במשך 48 h.
      הערה: זמן הטיפול יכול לנוע בין 24 ל-72 שעות, בהתאם לחיידקים ולכימיקלים שבהם נעשה שימוש. ההשפעה הטיפולית או המונעת של DIM יכולה להיות מוערכת גם על ידי טיפול מקדים בתולעים עם פתוגנים ולאחר מכן טיפול בתולעים עם DIM (האפקט הטיפולי) או על ידי טיפול מקדים בתולעים עם DIM ולאחר מכן טיפול בפתוגנים (ההשפעה המונעת).
   3. להכנת צלחות עם תוספת FITC-דקסטרן, יש לערבב 2 מ"ל של E. coli OP50 מומת בחום עם 4 מ"ג של FITC-dextran. לאחר מכן, חלקו 100 μL של תערובת FITC-dextran ו- E. coli OP50 לעשרים צלחות אגר NGM טריות (60 מ"מ x 15 מ"מ) ואפשרו לצלחות להתייבש במשך שעה אחת על ספסל נקי.
      הערה: הריכוז הסופי של FITC-dextran בכל צלחת NGM יהיה 20 מיקרוגרם/מ"ל.
   4. הכינו חמש לוחיות NGM המכילות E. coli OP50 ללא FITC-dextran לטיפול בקרת הרכב. למטרה זו, חלקו 100 μL E. coli OP50 מומת חום לכל צלחת אגר NGM טרי (60 מ"מ x 15 מ"מ) ואפשרו לצלחות להתייבש במשך שעה על ספסל נקי.
      הערה: עבור כל ניסוי עצמאי, נדרשות חמש עשרה צלחות NGM בתוספת FITC-dextran וחמש צלחות NGM ללא FITC-dextran.
   5. לאחר 48 שעות של טיפול (משלב 2.2), שטפו את התולעים עם חיץ S, העבירו את התולעים לצלחות בתוספת FITC-dextran וללוחות NGM ללא FITC-dextran, ודגרו על הצלחות למשך הלילה (14-15 שעות).
      הערה: עבור כל קבוצת טיפול, נדרשים 5 העתקים של צביעת FITC-דקסטרן (או הזנת בקרת רכב).
   6. שטפו את התולעים עם חיץ S ואפשרו להן לזחול בצלחת האגר הטרייה של NGM למשך שעה הערה: עבור כל ניסוי עצמאי, יש צורך בסך הכל ב-20 צלחות NGM טריות. בשלב זה, ניתן להשתמש בצלחת NGM בתוספת ללא או עם E. coli OP50.
   7. הוסיפו 50 μL של תמיסת פורמלדהיד 4% לכל באר של צלחת שחורה בעלת 96 בארות בעלות תחתית שטוחה. העבירו כ-50 תולעים מכל צלחת NGM לכל באר למדידות פלואורסצנטיות. לאחר 1 עד 2 דקות, להסיר ביסודיות את כל פורמלין מכל באר ולהוסיף 100 μL של אמצעי הרכבה כדי לצפות את הבארות.
      הערה: תמיסת פורמלדהיד (4%) משמשת לשיתוק ותיקון התולעים. עבור כל קבוצת טיפול, 5 בארות (5 העתקים) משמשים לניתוח תמונה.
3. הדמיה C. elegans עם מערכת ההדמיה Operetta וקביעת חדירות המעי על ידי מדידת ספיגת פלואורסצנטיות FITC-dextran
   NOTE:ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לניתוח תמונה במקום במערכת האופרטה.
   1. צלם תמונות פלואורסצנטיות ומדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות מערכת ההדמיה עתירת התוכן של אופרטה ונתח את התמונות באמצעות תוכנת הרמוניה.
   2. בתוכנת הרמוניה, לחץ על סמל פתח מכסה כדי לפתוח את המכסה ולהכניס את הצלחת למכונה.
   3. הגדר את הפרמטרים.
   4. לחץ על הגדר, בחר את סוג הלוח (96 בארות קורנינג שטוח-תחתית) והוסף את הערוצים (שדה בהיר וערוצי EGFP).
   5. התאם את הפריסה. עבור אל הבחירה פריסה ולאחר מכן בחר עקוב והתאם את הפרמטרים (תמונה ראשונה ב 1 מיקרומטר, מספר המטוסים הם 10, המרחק הוא 1 מיקרומטר).
   6. בחר אחת מבארות הטיפול ושדה לכידה אחד ולחץ על Test כדי לבדוק אם התמונות משביעות רצון במקטע Run experiment.
   7. אם התמונות משביעות רצון, חזור למקטע הגדרה ולחץ על סמל איפוס בסוף המסך. לאחר מכן, בחר את כל בארות היעד ומספר מתאים של שדות לכידה.
   8. עבור אל הפעל ניסוי שוב והזן את שם הצלחת ולאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל בעיבוד.
   9. כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות, עבור אל החלק ניתוח תמונה והזן את התמונה. מצא את התא על-ידי בחירת ערוץ EGFP ושיטה B. התאם את הסף המשותף ל- 0.5, שטח ל- >200 מיקרומטר², גורם פיצול ל- 3.0, סף בודד ל- 0.18 וניגוד ליותר מ- 0.18. לאחר מכן, חשב את מאפייני העוצמה ובחר את הממוצע כפלט. לחץ על סמל החל כדי לשמור את ההגדרה.
   10. עבור אל המקטע הערכה כדי למדוד את העוצמה על ידי קבלת מפת חום וטבלת נתונים. הגדר את הפרמטר Readout ל- Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well והתחל את ההערכה.
       NOTE: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   11. לחילוץ הנתונים מ-Operetta, לחץ על הלחצן Setting ובחר Data management.
   12. בחר כתוב ארכיון ולאחר מכן פתח את העיון ובחר את הקובץ.
   13. כדי לבחור את הקובץ, לחץ על האות + הקטן בפינה השמאלית ולאחר מכן לחץ על מדידה ובחר שם לוחית.
   14. בחר את הקובץ ולחץ על אישור.
   15. בחר בנתיב לשמירת הקובץ על-ידי לחיצה על האות עיון בנתיב הפעיל.
   16. לחץ על התחל כדי לשמור את קובץ הנתונים.
       NOTE: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
4. ניתוח סטטיסטי של פלואורסצנטיות FITC-dextran של C. elegans
   1. ייבא את הנתונים וחשב את הממוצע וסטיית התקן (SD) באמצעות תוכנת סטטיסטיקה.
   2. נתח את ההבדל המשמעותי באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Tukey.

תוצאות

איור 1: ההשפעה של DIM על חדירות המעי של C. elegans שניזונו מ-P. aeruginosa.תמונות מיקרוסקופיות של תולעים מ-(A) E. coli OP50 ללא הזנת FITC-דקסטרן, (B) E. coli עם הזנת FITC-דקסטרן, (C) P. aeruginosa PAO1 עם הזנת FITC-דקסטרן, ו-(D

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3,3'-דיינדולילמתאן	סיגמא	D9568
90×15 מ"מ צלחות פטרי	SPL מדעי החיים, קוריאה הדרומית	10090
Bactor Agar	בקטון דיקינסון	מספר נכס 214010
תמיסת פורמלדהיד	סיגמא	F1635
Caenorhabditis elegans N2	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)		סוג פראי
כולסטרול	סיגמא	C3045
Costa Assay, 96 שחור היטב עם תחתית שטוחה שקופה ללא טיפול, ללא מכסה פוליסטירן	קורנינג מאוגדת	מספר נכס 3631
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא	D2650
Escherichia coli OP50	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - דקסטרן	סיגמא	FD10S
Harmony	פרקיןאלמר		לעומת 3.5
מגנזיום גופרתי הפטהידראט	פישר ביוריאגנטים	BP2213-1
מדיום הרכבה מימי Fluoromount	סיגמא	F4680
אופרטה CLS מערכת ניתוח תוכן גבוהה	פרקיןאלמר	HH16000000
פפטון	מרק	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	אוסף קוריאני לתרבות טיפוס	KCTC מס' 1637
נתרן כלורי	פישר ביוריאגנטים	BP358-1
מיקרוסקופ סטריאו	Nikon, יפן	SMZ800N