Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

תקציר

מקור: Farboud, B. et al, עריכת גנום משופרת עם Cas9 ריבונוקלאו פרוטאין בתאים ואורגניזמים מגוונים.J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018).

1. הרכבת RNP

1. תכננו את הניסוי מבעוד מועד, ורכשו מראש את כל מרכיבי הרנ"א, הדנ"א והחלבון. כמעבר ראשון, נסה את אחת הבקרות החיוביות המפורטות בטבלה 1 והשתמש בריאגנטים המסחריים המתוארים בטבלת החומרים כדי להבטיח תכנון ניסויי אמין ואת שלמות החומרים. לטיפים נוספים על תכנון ניסוי חדש בעריכת גנום, ראו מאמרים בנושא זה.
   הערה: לאחר ההרכבה כמתואר בשלבים הבאים, RNPs שהוכנו מראש עשויים להיות מאוחסנים ב -80 °C.
   1. לאחר בחירת הגן שיש להתמקד בו, השתמש באחד הכלים המקוונים החינמיים כדי לתכנן gRNA אופטימלי. הקפד לכוון לאקסון אם אתה מקווה ליצור נוקאאוט.
      NOTE: כלים אלה יסייעו לזהות אתר יעד עם רצף PAM סמוך של S. pyogenes, ציון באיכות גבוהה וציון נמוך מחוץ למטרה.
   2. לטהר את חלבון S. pyogenes Cas9 באמצעות שיטות שפורסמו או לרכוש אותו מספק מסחרי.
   3. הכינו חיץ Cas9 טיפוסי לדילול RNA, הכנת RNP ואחסון חלבונים, המכיל 20 מילימטר של HEPES pH 7.5, 150 מילימטר של KCl, 10% גליצרול ו-1 מילימטר של TCEP. השתמש תמיד במים נטולי נוקלאז במאגרים שישמשו להשעיה או דילול RNA כדי למנוע התפרקות.
   4. הפק את הרנ"א המנחה (tracrRNA ו- crRNA או sgRNA) באמצעות שעתוק חוץ גופי בשיטות שפורסמו, או רכוש אותו מחברת סינתזת חומצות גרעין.
   5. אם מכניסים גן, יש לסנתז או לרכוש תבנית DNA של תורם.
   6. יש לאחסן את החלבון ואת ה-RNA aliquots בטמפרטורה של -80°C ולהפשיר על קרח מיד לפני השימוש.
      הערה: כל הקפאה-הפשרה מורידה מעט את היעילות. פרוטוקולים מפורטים בגישה פתוחה לטיהור Cas9 ושעתוק חוץ גופי של sgRNA זמינים במקומות אחרים.
2. הכנת RNP לעריכת C. elegans: הרכבת קומפלקס RNP על ידי הוספת הריאגנטים הבאים על מנת ליצור נפח סופי של 20 μL (הריכוזים הסופיים מצוינים בסוגריים): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7.5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), ותבניות התיקון במידת הצורך (0.5 מיקרומטר ssDNA או עד 350 ng/μL dsDNA).
   הערה: היעילות של תיקון DSB בתיווך Cas9 פרופורציונלית לריכוז מבנה תיקון dsDNA; לכן, ככל שהריכוז של תבנית התיקון גבוה יותר, כך התיקון בתבנית יעיל יותר. עם זאת, הזרקה של תערובות המכילות יותר מ -350 ng/μL של dsDNA הוכחה כמפחיתה את הכדאיות של התולעים המוזרקות. לכן, עדיף להשתמש בעד, אך לא יותר מ 350 ng / μL של dsDNA בתערובת כדי למקסם את יעילות התיקון תוך מזעור הקטלניות שלה.
   1. הוסף crRNA מרובים כדי להתמקד במספר מוקדים בו זמנית, לפי הצורך עבור גישת הסינון co-CRISPR/co-conversion. בעת הוספת יותר מ- crRNA אחד, הוסף כל אחד מהם ברצף לתערובת האב.
      הערה: הכמות של כל crRNA אינה חייבת להיות זהה, ואפילו הכפלת הריכוז הכולל של crRNA בתמהיל האב מבלי לשנות את ריכוז Cas9 אינה מפריעה לתדירות המוטגנזה בלוקוס מסוים. דוגמאות מתוארות בפירוט Paix et al.
   2. מערבבים על ידי צנרת ומסובבים את תמיסת ה-RNP ב-16,000 x גרם במשך 5 שניות כדי להבטיח שתמיסה נאספת בתחתית הצינור.
   3. לדגור את התמיסה ב 37 ° C במשך 15 מ '.
   4. צנטריפוגה את הדגימה ב 16,000 x גרם במשך 1 דקה כדי לזרוק כל חלקיק שיכול לסתום את מחט מיקרו הזרקה דק משועמם. השתמש supernatant בשלבים הבאים.
3. הכנת ג. אלגנס

1. יום אחד לפני המיקרו-הזרקה: הכינו את רפידות האגרוז למיקרו-הזרקה.

1. הכינו תמיסת אגרוז 3% (w/v) במים על ידי הוספת אגרוז למים והבאת התמיסה לרתיחה על פלטה חמה או במיקרוגל.
2. סדרו שקופיות זכוכית כיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ x 1.5 מ"מ על שולחן והשתמשו בפיפטת פסטר מזכוכית כדי להניח טיפה קטנה (~ 15 μL) של תמיסת אגרוז על המגלשה. שטח במהירות את טיפת האגרוז על ידי הנחת כיסוי נוסף על גבי. הניחו לאגרוז להתמצק ולאחר מכן הסירו את אחת הכיסויים.
3. השאירו את הכיסוי מצופה האגרוס עם הפנים כלפי מעלה על השולחן למשך הלילה לייבוש. לאחר 24 שעות, אחסנו את רפידות האגרוז במיכל נקי ויבש.
   NOTE: אלה יכולים לשמש ללא הגבלת זמן.

2. משוך את מחטי המיקרו-הזרקה: באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט עם חוטים (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ וקוטר פנימי 0.58 מ"מ), משוך את המחטים על בסיס מלו ואש⁵⁷ ומשאבים אחרים. ניתן להשתמש במחטים באופן מיידי או לאחסן אותן במיכל נקי ויבש, המחובר לתומכי חימר.

3. לתחזוקת התולעים, הכינו אגר Nematode Growth Media (NGM) שנשפך לצלחות פטרי וזוהה עם חיידקי OP50 (לפרוטוקולים על תחזוקת C. elegans סטנדרטית ומתכונים למצע גדילה, ראו Stiernagle).

4. שלב את התולעים למיקרו-הזרקה: 12-24 שעות לפני המיקרו-הזרקה, בחר הרמפרודיטים בשלבי L4 לצלחת חדשה של NG-agar עם חיידקי OP50 ודגר עליהם למשך הלילה ב -20 מעלות צלזיוס. עבור כל תערובת מטרה / הזרקה Cas9, בחר ~ 30 תולעים לצלחת.

4. יום של מיקרו-הזרקה: טען את מחט המיקרו-הזרקה המשוכה בסופרנאטנט תמיסת RNP שהוכן בשלב 1.2.
   1. פיפטה הסופרנאטנט משלב 1.2.4 לתוך פיפטה נימית משוכה וממלאת את התמיסה מהפיפטה הנימית למחט המיקרו-הזרקה המוכנה (בדרך כלל העמסה של פחות מ-0.1 מיקרוליטר).
5. הרכיבו את המחט הטעונה על מכשיר המיקרו-הזרקה המחובר למיקרומניפולטור. הגדר את לחץ מנגנון ההזרקה ל- 250 kPa ואת לחץ שיווי המשקל ל- 25 kPa.
6. שברו בחזרה את קצה המחט הטעון כדי ליצור קצה מחט חד. הניחו מכסה מרובע בגודל 15 מ"מ x 15 מ"מ x 1.5 מ"מ על חלקו העליון של כיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ x 1.5 מ"מ.
   1. כיסוי קצה אחד של הכיסוי המרובע בשמן הלוקרבון 700.
   2. מקמו את המחט בשמן, בקצה הכיסוי המרובע בקוטר 15 מ"מ.
   3. בעזרת יד להנחיית שלב המיקרוסקופ והכיסוי, הברישו את המגלשה מעלה ולאורך קצה המחט תוך לחיצה על דוושת/כפתור ההזרקה. שברו את קצה המחט לאחור, והגדילו את זרימת הנוזל אל מחוץ למחט. השג קצב זרימה אופטימלי על ידי הפיכת תערובת ההזרקה לזרום לאורך קצה המחט, וליצור ~ 1 בועה לשנייה.
7. יש לאשר כי תולעי L4 שנקטפו 12-24 שעות לפני המיקרו-הזרקה הן צעירות בשלבים התפתחותיים ביום ההזרקה. בחרו את התולעים הבוגרות הצעירות לצלחת NG-agar שחסרה חיידקי OP50 ואפשרו להן לזחול במשך 5 דקות. פעולה זו מפחיתה את כמות החיידקים המועברת לכרית ההזרקה, וממזערת את סתימות המחטים.
8. הניחו כרית/כיסוי הזרקת אגרוז על טווח דיסקציה. בעזרת קוטף תולעים, הניחו מסילה קטנה של שמן הלוקרבון לאורך קצה אחד של הפד.
9. בעזרת קוטף התולעים המצופה בשמן, הרימו מספר תולעים מצלחת הגז הטבעי אל מסלול השמן. בעזרת שיער דק המחובר לפיפטה, כגון ריסים או שפם חתול, מקמו את התולעים במקביל, ודחפו בעדינות את התולעים לתוך כרית האגרוז. עד שנוח עם הליך מיקרו-הזרקה, יש להרכיב ולהזריק רק תולעת אחת בכל פעם.
   הערה: האגרוז היבש ינדף את הלחות מהתולעים, ויגרום להן להידבק לרפד. כתוצאה מכך, יש לעבוד במהירות מכיוון שהתולעים יכולות להתייבש.
   1. ברגע שהם במקומם ומחוברים לרפד, מכסים את התולעים עם עוד כמה טיפות של שמן הלוקרבון (~ 20 μL) מקצה קוטף התולעים.
10. C. elegans Gonad Microinjection with RNPs and Post-injection Care
    פרוטוקול המיקרו-הזרקה מעובד מ-Mello and Fire ומתואר בפירוט במקומות אחרים.
    1. הניחו את הכיסוי עם התולעים המותקנות על מיקרוסקופ ההזרקה. תחת הגדלה נמוכה (5X אובייקטיבי, 10X עיני), מקם את התולעים בניצב למחט ההזרקה.
       1. עוברים להגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי, 10X עיני), מקמים מחדש את המחט הסמוכה לזרוע הגונד המתאימה לאזור הסמוך לגרעינים באמצע עד סוף הפכיטן.
       2. באמצעות micromanipulator, להזיז את המחט נגד התולעת, מדכא את הקוטיקולה מעט. לאחר מכן, ביד אחת, הקש על הצד של שלב המיקרוסקופ כדי לטלטל את המחט דרך הקוטיקולה. לחצו על דוושת/כפתור ההזרקה ומלאו לאט לאט את זרוע הגונד בתערובת ההזרקה והסירו את המחט.
       3. חזור על שלב זה עם זרוע הגונד השנייה.
    2. לאחר הזרקת התולעים, הסירו את כרית הכיסוי/אגרוז והניחו אותה תחת מיקרוסקופ נתיחה.
       1. באמצעות פיפטה נימית משוכה, להזיז את השמן מן התולעים על ידי pipeter חיץ M9 מעליהם. בצע טיפול זה כדי לשחרר את התולעים מהאגר.
       2. לאחר 10 דקות, כאשר התולעים מתרוצצות בחיץ, העבירו אותן לצלחת NG-agar עם חיידקי OP50 באמצעות פיפטה נימית משוכה. מניחים את הצלחת על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות עד התולעים התאוששו והם זזים.
    3. לאחר ההחלמה, העבירו בנפרד את התולעים לצלחות NG-agar עם OP50 והעבירו את הצלחות לאינקובטור של 25°C.
    4. לאפשר לתולעים המוזרקות P 0 לגדול ולהניח צאצאים במשך 3 ימים. סנן את צאצאי F ₁.
       1. אם אתה משתמש ב- co-CRISPR או בהמרה משותפת, בחר את התולעים המועמדות לסינון בהתבסס על האם יש להן את הפנוטיפ המוטנטי של גן הייחוס. העבירו בנפרד את התולעים המסומנות הללו ללוחות NG-agar חדשים עם OP50 ואפשרו להם להניח צאצאי F₂ בטמפרטורה של 20°C.
          NOTE: הפנוטיפ המשמש להקרנה או בחירה של CO-CRISPR אמור לספק הערכה מוקדמת להצלחת עריכת Cas9.
       2. אם הפנוטיפ co-CRISPR אינו קיים, הזריקו מיקרו-הזרקה של פלסמיד בקרה חיובי כדי לסייע בשיפור יעילות המיקרו-הזרקה.
          NOTE: לדוגמה, הכללת פלסמיד בתמהיל ההזרקה המקודד MYO-2 המתויג על ידי mCherry תסייע להעריך את יעילות ההזרקה. תולעים שהוזרקו בהצלחה עם pCFJ90 יולידו כמה צאצאים עם לוע פלואורסצנטי.
    5. בדוק את תולעי F₁ לנוכחות העריכות הרצויות. בחר את האם F₁ לבאר בודדת של צלחת 96 בארות, לשכב אותה, ולבחון את ה- DNA שלה על ידי הגברת PCR ספציפית להחדירה, ניתוח רצף DNA, או בדיקת נוקלאז מודד (CEL-1).
       NOTE: ניתן לבצע בדיקות אלה בעת שימוש ב- co-CRISPR/co-conversion או במשטרי סינון או בחירה אחרים.

תוצאות

טבלה 1: בקרות חיוביות לניסויים ראשוניים בעריכת גנום.טבלה זו מציגה את המידע העיקרי הדרוש לביצוע ניסוי עריכת גנום בפעם הראשונה בכל אחד מהתאים והאורגניזמים המתוארים בפרוטוקול זה. מעקב אחר פרמטרים אלה עשוי להניב תוצאה מוצלחת שניתן להשתמש בה כדי לבחון את הפרוטוקול או כבסיס להשוואה ברגע שהנסיין מכוון לגן שמעניין אותו. F: קדימה, R: הפוך, HDR: תיקון מכוון הומולוגיה.

חומרים