קרינת UV: שיטה לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים

תקציר

מקור: Mariol, M. C et al. פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים בעלי קצב שידור גבוה לגנום C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

הזרקה זעירה של טרנסגנים גורמת בדרך כלל לזני C. elegans עם מערכים חוץ-כרומוזומליים גדולים, הגורמים לביטוי והעברה משתנים של הטרנסגן. קרינת UV יכולה לגרום לאינטגרציה כרומוזומלית של המערך ולהעברת טרנסגנים יציבה יותר.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Mariol et al, A Rapid Protocol for Integration Extrachromosomal Arrays with High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp.(2013).

1. הקרנת UV והתאוששות של תולעים טרנסגניות

1. הקרנת תולעים:
   1. בחרו 30-100 חיות L4 טרנסגניות פלואורסצנטיות על צלחות תרבית נפרדות (15-20 חיות בצלחת).
   2. מניחים את הצלחות, עם הסרת המכסות, בקרוס-לינקר UV. להקרין את התולעים ב 0.012 J / cm². שים לב כי זנים רגישים פחות או יותר UV וכי התוצאות יכולות להיות משתנות בהתאם למקרין UV בשימוש. ניתן לבדוק טווח מינון בין 0.010-0.015 J/cm².
2. התאוששות תולעים לאחר הקרנה:
   1. יש להניח צלחות עם תולעים מוקרנות למשך הלילה בטמפרטורה של 15°C להתאוששות.
   2. בדוק את מספר החיות שחיות. בידינו, שיעור הישרדות של כ-80-90% מותאם להקרנה יעילה.
   3. לגדל את החיות המוקרנות ב 15-25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים מגיעים לשלב ההתפתחותי המאפשר תצפית על ביטוי סמן coinjection.

2. בידוד קווים טרנסגניים משולבים

1. מבחר בעלי חיים בפורמולה 1:
   1. חיות F1 פלואורסצנטיות בודדות של 150-200 על צלחות תרבית נפרדות. עבור קווים משדרים מאוד (≥80%), 100 בעלי חיים F1 מספיקים.
   2. שמור על לוחות F1 אלה ב 15-25 ° C עד הצאצאים מגיע לשלב המתאים לתצפית של חיות F2 פלואורסצנטי.
   3. השליכו את כל לוחות F1 המציגים i) ללא צאצאים, המציינים כי חיית F1 הייתה סטרילית או מתה, או ii) לא או רק מעט חיות פלואורסצנטיות F2, דבר המצביע על כך שבעל החיים F1 לא העביר את הטרנסגן בקצב הצפוי. צעד זה מהיר ומהווה יתרון של ממש בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הדורש הערכה של אחוז התולעים הפלואורסצנטיות F2 על מנת לבחור לוחות F1 המציגים ≥75% צאצאים פלואורסצנטיים (טבלה 1).
2. מבחר בעלי חיים F2:
   1. ארבע חיות F2 טרנסגניות פלואורסצנטיות מכל צלחת F1 שנבחרה. בעת שימוש בטרנסגנים פלואורסצנטיים (לדוגמה mCherry, gfp או dsRed), בחר תולעי F2 עם רמה גבוהה של פלואורסצנטיות מכיוון שזה יכול להצביע על כך שבעלי חיים אלה הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב. שימו לב שכאשר בוחרים בעלי חיים מסוג F2 חשוב מאוד לא לסחוב ביצים או זחלים, על מנת להימנע מתוצאות שליליות שגויות בשלב הבא.
   2. לגדל בעלי חיים F2 ב 15-25 מעלות צלזיוס.
3. בידוד ותיקוף זנים טרנסגניים משולבים:
   1. מסך F2 לוחות עבור 100% תולעי F3 טרנסגניות פלואורסצנטיות. המסך מהיר למדי מכיוון שנוכחותה של תולעת אחת שאינה פלואורסצנטית מצביעה על כך שיש לזרוק את הצלחת. הומוזיגוט בעל חיים F2 עבור הטרנסגן המשולב ייתן 100% צאצאים פלואורסצנטיים הומוזיגוטיים.
   2. שמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים F3 בודדים מלוחות נבחרים כדי לאשר את התורשה של 100% של הטרנסגן. בתיאוריה, בחירת חיה אחת מספיקה בשלב זה. עם זאת, בחירת שמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים F3 עשויה להיות נחוצה כדי להימנע מבחירת בעלי חיים לא פוריים או לא בריאים, שכן קרינה יכולה לגרום באופן אקראי למוטציות המשפיעות על גנים החשובים לפיזיולוגיה של התולעים.
   3. במידת האפשר, לשמור על מספר זנים טרנסגניים משולבים עצמאיים, כלומר זנים שנמצאו מבעלי חיים שונים בפורמולה 1.

תוצאות

טבלה 1. השוואה בין הפרוטוקולים הסטנדרטיים והמשופרים לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים בגנום C. elegans.שני טרנסגנים לא משולבים המשדרים בערך באותו תדר שולבו באמצעות התקן או הפרוטוקול המשופר. ההבדל העיקרי טמון בעובדה כי בפרוטוקול סטנדרטי מסך של הצאצאים על כל לוחות F1 מבוצע כדי להעריך את אחוז תולעי F2 טרנסגניות, אשר צריך להיות ≥ 75%. שלב זה לוקח זמן רב, במיוחד אם קצב ה...

חומרים

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:580px;" width="579"> רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה שם חברה מספר קטלוג הערות U.V. cross-linker Fischer Scientific אורך גל 254 ננומטר Microscope SteREO Discovery V8 Carl Zeiss, Inc. Petri dishes, 60 mm CML BPS55E6 חוט פלטיניום 0.25 מ"מ אלפא עזר 6/4/7440 כדי לבחור תולעים