בדיקת לכידת טרף: שיטה לחקר התנהגות לכידת הטרף של זחלי זברה

תקציר

מקור: Muto, A., et al. אבלציה של אוכלוסיית תאי עצב באמצעות לייזר דו-פוטוני והערכתה באמצעות דימות סידן ורישום התנהגותי בזחלי דגי זברה. J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מתאר את מבחן לכידת הטרף. הסרטון דן בשיטה לחקר התנהגות לכידת טרף של זחלי דגי זברה לאחר אבלציה בלייזר של נוירונים ספציפיים.

פרוטוקול

1. הערכת השלכות התנהגותיות בעקבות אבלציה בלייזר

1. הגדר מערכת הקלטה התנהגותית המורכבת מסטריאוסקופ המצויד במצלמת וידאו. השתמשו במצלמה עם תוכנה מתאימה לרכישת תמונות, מסחרית או מותאמת אישית (איור 1A).
2. מטב את תנאי התאורה כך שניתן יהיה לזהות את הפרמציום באמצעות עיבוד תמונה. לדוגמה, השתמשו בנורת LED לבנה טבעתית עם ספייסר (איור 1B).
   הערה: המרחק מהנורית והזווית שלה משפיעים על מראה הדגימה (כלומר, בהירים ברקע כהה או כהים ברקע בהיר) ולכן הם קריטיים לעיבוד תמונה מוצלח. קבעו את הגובה הטוב ביותר של הספייסר (איור 1C).
3. הניחו זחל של דג זברה (שהוחזר מניסוי אבלציה בלייזר המתואר בסעיף 1) בתא רישום התנהגותי (שהיה מחובר לשקופית זכוכית) עם הסרת האטם העליון המקורי (איור 1D).
4. אספו 50 פרמציה תלויה במים מהכוס באמצעות מיקרופיפטה והניחו אותם בתא ההקלטה.
5. הניחו פתק כיסוי על גבי תא ההקלטה. הניחו טיפה קטנה של מים על חלקת הכיסוי לפני הנחתה על משטח המים של תא ההקלטה כדי למנוע החדרת אוויר לחדר.
   הערה: בשלב זה, חלק מהמים עם פרמציה יעלו על גדותיהם מתא ההקלטה. המספר הנותר של פרמציה בחדר ההקלטה יהיה כ 30-40.
6. הניחו את תא ההקלטה (המכיל זחל ופרמציה) במערכת התאורה (איור 1D).
7. התחל את הקלטת קיטועי הזמן בקצב של 10fps למשך 11 דקות (6,600 פריימים).
8. (אופציונלי) עבור כל זחל שנבדק להתנהגות, יש לבחון את הפלואורסצנטיות של האזורים המוקרנים בלייזר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את יעילות האבלציה בלייזר (כלומר, היעדר, או מספר מופחת משמעותית של תאים פלואורסצנטיים באזור המוקרן בלייזר).
   הערה: גם לאחר הקרנה, עדיין ניתן לצפות בחלק מהתאים הפלואורסצנטיים עקב הופעה מאוחרת יותר של גן Gal4 בתאים שהתמינו לאחר אבלציה.
9. לאחר רישום התנהגות הזחל, כדי לפצות על חוסר האחידות ברקע, בצעו חלוקה של פיקסל אחר פיקסל של כל פריים בתמונה ממוצעת בפיג'י: לחצו על 'תהליך', 'מחשבון תמונות', 'פעולה: חלוקה', 'תוצאת 32 סיביות (ציפה)' ו'אישור'. כדי ליצור תמונה ממוצעת, לחצו על 'תמונה', 'ערימות', 'Z-Project', 'עוצמה ממוצעת' ו'אישור' (איור 1E, F).
10. ספור את מספר הפרמציה שנותרה בתא על ידי לחיצה על 'נתח', 'נתח חלקיקים', הגדרת טווח שטח המכסה את כל הפרמצ'יה, סימון תיבת הסימון 'הצג:מסכות' ולחיצה על 'אישור'. האפשרות 'הצג:מסכות' תספק תמונת פרמציה שחולצה (איור 1G), עם רשימה של מספר החלקיקים (פרמצ'יה) בכל פריים.
11. התווה את מספר הפרמציה שנותרה בחדר ההקלטה לאורך זמן. מכיוון שההערכות של מספר הפרמציה רועשות, אנו ממליצים לבצע ממוצע נע בכל נקודה בטווח של 600 פריימים (דקה אחת) בגיליון האלקטרוני.

תוצאות

איור 1. בדיקת לכידת טרף ונתונים מייצגים בזחלי דגי זברה בלייזר.(A) מערכת הקלטה התנהגותית. הסטריאומיקרוסקופ היה מצויד במצלמת CMOS. התמונות נרכשו באמצעות סקריפט בהתאמה אישית. (ב) רכיבי מערכת התאורה. נייר בצבע אפור, מפזר זכוכית, טבעת לד לבנה, דיפיוזר, ספייסר בהתאמה אישית (קרטון) ודיפיוזר עם חור במרכז. (ג) מערכת התאורה שהורכבה מהחלקים המוצגים ב-B. (D) תא הקלט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי הדמיה	גרייס ביו-לאבס	תאי הדמיה CoverWell PCIA-2.5	משמש כתא הקלטה התנהגותי
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	דגם: C11440-22CU	מצלמת CMOS מדעית
SZX7	אולימפוס		סטריאוסקופ
טבעת נורית LED	CCS	דגם: LDR2-100SW2-LA	נורית LED לבנה
אטם תא הכלאה עם אטימה מאובטחת, 8 תאים, קוטר 9 מ"מ x עומק 0.8 מ"מ	בדיקות מולקולריות	קטלוג # S-24732	משמש כתא הקלטה בהדמיית Ca