מסך רעילות כימית מבוסס עוברים: הערכת השפעות על התפתחות עוברים של דגי זברה

תקציר

מקור: Hao J. et al., Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen. J. Vis. Exp. (2010)

במאמר זה, עוברים של דגי זברה משמשים לבדיקת רעילות כימית. רעילות כימית מתואמת עם קריאות פנוטיפ. פרוטוקול הדגימה מציג גישה מתודולוגית לביצוע בדיקת רעילות כימית.

פרוטוקול

1. העברת ספריית מולקולות קטנות

בעוד שהעברה מורכבת יכולה להיות אוטומטית בשיטות העברה רובוטיות, נתאר את שיטת ההעברה הידנית.

1. ספריות מולקולות קטנות מסופקות בדרך כלל בפורמט של 96 בארות, כאשר כל תרכובת מאוחסנת ב-DMSO כמלאי של 10 מילימטר. כ-60 דקות לפני שהעוברים מגיעים לשלב שבו יש להוסיף את התרכובות, מפשירים מספר רצוי של לוחות 96 בארות המכילים אליציטוטים של מולקולות קטנות (צלחת מקור). שימו לב למספר הזיהוי הסידורי או האחר של לוחיות המקור. כדי למזער את העיבוי על הלוחות, הפשרה יכולה להתרחש בתא ייבוש המכיל דריריט (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
2. סובבו בקצרה את הצלחות בצנטריפוגה שולחנית המצוידת במתאם לוחות רב-באר.
3. הסר את סרט האיטום מאלומיניום מלוח המקור. באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, לדלל את התרכובות בלוח המקור לריכוז של 0.5 mM (לדוגמה, אם מתחילים עם 250 nL aliquots של מלאי 10mM, להוסיף 4.75 μL של DMSO לכל באר).
4. כאשר העוברים בצלחת 96 בארות (צלחת הנמען) מגיעים לשלב הרצוי, השתמש בפיפטה של 12 ערוצים (2-20 μL) כדי להעביר 2.5μL של תרכובות (0.5mM) מלוחות המקור לתוך לוחות המקבל המכילים את העוברים.
5. רשום את מספר הזיהוי של לוחיות המקור על לוחיות העובר המקבל. כסו את לוחיות הנמענים המכילות כעת את העוברים והתרכובת עם מכסים, ערבבו בעדינות את הלוחות על ידי ערבול עדין, והניחו אותם באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס.
6. כסו כל לוחית מקור המכילה מולקולות קטנות שאינן בשימוש (0.5 מילימטר) בסרט איטום מאלומיניום והכניסו למקפיא בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.

2. סינון השפעות של מולקולות קטנות על ידי בדיקה חזותית של פנוטיפים

1. לפני ביצוע המסך, נסחו קריטריון ספציפי למה ייחשב "להיט".
2. בזמנים הרצויים בפיתוח, הוציאו מאינקובטור את לוחות 96 הקידוחים המכילים עוברים שטופלו בתרכובת ובחנו כל באר תחת סטריאומיקרוסקופ. להדמיה טובה יותר של שינויים עדינים, כגון שינויים בתבנית מחזור הדם, ניתן להשתמש במיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות פאזה. ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחון הפרעה בביטוי של חלבוני GFP או DsRed תחת מקדם ספציפי לרקמה.
3. סרוק במהירות את לוחות 96 הבארות עבור כל באר שבה לפחות 3 מתוך 5 עוברים מציגים את הפנוטיפ "פגע" שנקבע. רשום את זהות הצלחת ואת מיקום הבאר של כל פגיעה פוטנציאלית.
4. אשר מחדש פגיעה פוטנציאלית על ידי בדיקה חוזרת של השפעות התרכובת במספר מינונים (1 uM, 5 uM, 10 μM ו- 50 μM). עבור כל מנה, 10 עוברים נבדקים ב 0.5 מ"ל של מדיה E3 בפורמט צלחת 48 באר. עיתוי הוספת המתחם לבדיקה חוזרת צריך להיות זהה לעיתוי ההקרנה המקורית. פגיעה מאושרת כאשר הפנוטיפ שנוצר משוכפל בבדיקה חוזרת של התרכובת
5. זהה את התרכובת הפוגעת מתוך מסד הנתונים של מולקולות קטנות בספרייה הכימית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ספריית מולקולות קטנות של תרכובות מגוונות מבחינה מבנית המסודרות בפורמט של 96 וולט במלאי של 10 מילימטר ב- DMSO. כל צלחת מאסטר מחוברת ללוחות אחסון פוליפרופילן בעלי 96 בארות (קורנינג), ומאוחסנת בטמפרטורה של -80°C עד ל שימוש.
דרייריט	W.A. HAMMOND DRIERITE CO, קסניה, אוהיו
פיפטות 12 ערוצים, 2-20 μL	אפנדורף
סרט איטום אלומיניום לפלטות 96 בארות	Nunc , רוצ'סטר, ניו יורק
DMSO	Sigma , סנט לואיס, מיזורי
אינקובטור בסיסי, 28.5°C	פישר סיינטיפיק
פוליסטירן 96 צלחות בדיקה עגולות היטב	קורנינג קוסטאר; לואל, מסצ'וסטס
סטריאומיקרוסקופ עם בסיס אור משודר	Leica Microsystems, Bannockburn, IL
E3 עובר בינוני: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 , המכיל 0.003% PTU (phenylthiocarbamide, Sigma; סנט לואיס, MO).			ניתן להכין PTU כתמיסה של 10x על ידי המסת 0.3-g PTU ב-1 ליטר של מדיה עוברית E3. פתרונות המכילים PTU צריכים להיות מוגנים מפני אור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.