אבלציה ממוקדת בכבד: גרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים

תקציר

מקור: Choi T.Y., et al. אבלציה ספציפית להפטוציטים בדגי זברה לחקר התחדשות כבד מונעת מרה. J. Vis. Exp. (2015)

המאמר מתאר אבלציה ממוקדת בכבד, שיטה לגרימת מוות של הפטוציטים עם מטרונידזול בזחלי דגי זברה טרנסגניים. פרוטוקול הדגימה מתאר את התהליך ליצירה, מניפולציה והערכה של אבלציה ממוקדת בכבד בדגי זברה.

פרוטוקול

1. הכנת עוברים/זחלים

1. מעבירים 100 עוברים לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ עם 25 מ"ל מי ביצה. אין לשמור יותר מ -100 עוברים לכל צלחת פטרי ולגדל אותם ב 28 ° C.
2. כדי לעכב פיגמנטציה, הוסף פנילתיאוריאה (PTU) לצלחות הפטרי לפני 10 שעות לאחר ההפריה (hpf), והגדל עוברים/זחלים עד 80 hpf. הריכוז הסופי של PTU הוא 0.2 mM.
   זהירות: PTU הוא רעיל. יש להשתמש בהתאם להנחיות הטיפול המתאימות.
3. מרדימים את הזחלים על ידי הוספת 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine), בריכוז סופי של 0.016%, לתוך צלחות פטרי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, מיין זחלים חיוביים CFP. השתמש בזחלים עם גודל כבד דומה והשלך את אלה עם כבד קטן או גדול יותר.
   הערה: ניתן להשתמש בכל זחל חיובי ל- CFP, ללא קשר לעוצמה, מכיוון שאין הבדל במידת אבלציה של הפטוציטים בין הזחלים המיזיגוטיים וההומוזיגוטים.
   זהירות: טריקאין הוא רעיל. יש להשתמש בהתאם להנחיות הטיפול המתאימות.
4. מוציאים את מי הביצים המכילים טריקאין ומוסיפים מי ביצה בתוספת 0.2 mM PTU. שמור את העוברים / הזחלים ב 28 ° C.

2. טיפול במץ

1. הכינו תמיסת Mtz טרייה של 10 mM על ידי המסת 0.171 גרם אבקת Mtz במי ביצים של 100 מ"ל בתוספת 0.2% DMSO ו-0.2 mM PTU. כדי להמיס לחלוטין את Mtz, מערבבים את התמיסה ב- RT עם ערבוב מהיר במשך 20-30 דקות. כדי לסייע במסיסות Mtz ולהגביר את חלחול Mtz לזחלים, הוסף DMSO בעת הכנת Mtz.
   אזהרה: חשיפה ממושכת או ריכוז מוגבר של Mtz היא רעילה. יש להשתמש בהתאם להנחיות הטיפול המתאימות.
2. הפרידו את הזחלים לקבוצות ביקורת וניסוי על ידי העברת מספר הזחלים הרצוי לשתי צלחת פטרי 100 מ"מ או צלחת מרובת בארות. עבור קבוצת הניסוי, לשמור את הזחלים בתמיסת 10 mM Mtz; עבור קבוצת הביקורת, יש לשמור אותם במי ביצים המכילים 0.2% DMSO.
3. מכסים את הצלחות או צלחות הפטרי המכילות את תמיסת Mtz ברדיד אלומיניום כדי למנוע את השבתת הפוטו של Mtz, ודגרים בטמפרטורה של 28°C. משך הטיפול ב-Mtz תלוי בשלב הזחל ובקו המהונדס.

3. ניתוח של התחדשות כבד מונעת מרה

1. בתום תקופת האבלציה, הסר את תמיסת Mtz מהלוחות. שטפו את הזחלים שטופלו ב-Mtz על ידי הוספת 25 מ"ל מי ביצה. מערבלים את הצלחת 2-3 פעמים כדי לשטוף את הזחלים לפני השלכת מי הביצה. חזור על הפעולה שלוש פעמים ולאחר מכן לטבול את הזחלים פעם נוספת במי ביצה. כדי למנוע בצקת לב ומוות זחלים בזחלים שטופלו ב-Mtz, הוסיפו ריכוז נמוך יותר של טריקאין, בריכוז סופי של 0.008%, כדי לשתק את הזחלים.
2. לניתוח כבד, בחנו את גודל הכבד של הזחלים שטופלו ב-Mtz תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנן CFP. להעריך את רמות אבלציה hepatocyte בהתבסס על גודל הכבד היחסי: גדול (לא ablated; 0-10% זחלים), בינוני (ablated חלקית; 10-20%), וקטן מאוד (ablated מלא; 80-90%).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3-אמינו חומצה בנזואית אתיל אסטר (Tricaine) אבקה	סיגמא-אולדריץ'	A5040	הכינו 0.4% (15 מ"ר) ממלאי טריקאין: הביאו 0.4 גרם טריקאין ל-100 מ"ל עם מי ביצה. התאם ל- pH 7.
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	D8418
מטרונידזול	סיגמא-אולדריץ'	M1547
N-פנילתיאוריאה (PTU)	סיגמא-אולדריץ'	P7629
צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ	דנוויל סיינטיפיק בע"מ	M5300
מי ביצים			0.3 גרם/ליטר מלחי ים 'אוקיינוס מיידי' ו-0.5 מ"מ CaSO4 במים מזוקקים.
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי	לייקה מיקרוסיסטמס	M205FA