הזרקת מורפולינו: שיטה להפיל ביטוי גנים במטרה לחקור תפקוד בדגי זברה

תקציר

מקור: Hyde D.R., et al. In vivo אלקטרופורציה של מורפולינוס לסנפיר זנב הזברה הבוגר המתחדש. J. Vis. Exp. (2012)

הפרוטוקול מתאר הפלה ממוקדת של ביטוי גנים בדגי זברה על ידי הזרקת מורפולינו בזנב.

פרוטוקול

1. הזרקת מורפולינו

1. יום לפני הזרקת המורפולינו, הכינו צלחת הזרקה (איור 1). הקפידו לחתוך חריץ בקצה אחד של הבאר, מה שעוזר לייצב את הדג להליך המיקרו-הזרקה.
2. לדלל את מורפולינו מתויג פלואורסצאין לריכוז הנכון (מומלץ להתחיל עם 1.2 mM) ומניחים באמבט מים 65 °C, במשך 5 דקות.
3. טען את המחט עם המורפולינו (הערה: תלוי אם אתה ממלא אחורה או טוען קדימה המחט שלך יקבע אם אתה טוען את המחט קודם, או לחתוך את הקצה הראשון).
4. חותכים את קצה המחט בזווית.
5. עקוב אחר ההוראות של מערכת המיקרו-הזרקה שלך כדי להזריק בועה של כ-5 nl של מורפולינו בכל הזרקה. כמויות גדולות יותר של מורפולינו עלולות לשבש את הרקמה.
6. מרדימים את הדג ומניחים על צלחת הזרקה. הסירו את כל עודפי הנוזלים וכוונו את המחט למיקום המתאים, פשוט דיסטלי לקרן הגרמית (איור 2). באמצעות מיקרוסקופ ומכשיר מיקרו-הזרקה המתאימים להזרקות מורפולינו (ראו טבלת ריאגנטים ספציפיים), הזריקו את המורפולינו לתוך הסנפיר מהקדמי לאחורי, כפי שמוצג באיור 2. הזרקה מאחורית לקדמית גורמת לרקמת הסנפיר להתגלגל במהלך ההזרקה והיא קשה מאוד.
7. הכניסו את המחט בעדינות לתוך הרקמה הרגנרטיבית, פשוט דיסטלית לכל קרן גרמית (מסומנת "1" באיור 2) ודחפו באופן מרוחק עד שהיא ממוקמת בבלסטמה (מסומנת "2" באיור 2). היזהר לא לדחוף את המחט דרך כל הסנפיר. כאשר המחט ממוקמת כראוי, להזריק את מורפולינו (כלומר, לחץ פעם אחת). ב 1.2 mM, תמיסת מורפולינו מתויגת פלואורסצאין נראה צהוב-ירוק, אפילו בתנאי אור רגילים. עם כל זריקה, "נשיפה" צהובה של פתרון מורפולינו ניתן לדמיין, אשר מסייע למקם את הזריקה כדי blastema. יש להזריק כ-75 nl (10-15 קליקים) של תמיסת מורפולינו לכל קרן גרמית. השהה ~ 1 שנייה בין לחיצות. אנו מזריקים רק את הצד הגבי, תוך שימוש בגחון כבקרת אלקטרופורציה בלבד.

תוצאות

איור 1. A. סכמה של צלחת ההזרקה, אשר עשויה מאגרוז ומכילה באר קטנה לאחיזת הדג במהלך מיקרו-הזרקה של המורפולינו.

איור 2. סכמטי של מיקרו-הזרקת מורפולינו. א. מניחים את הדג בתבשיל כשראש הדג בחריץ החתוך מהבאר, מה שיעזור לדג להישאר יציב. ב. בהגדלה נמוכה, סדרו את המחט כ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מורפולינו	GeneTools, LLC		מורפולינו צריך להיות מותאם אישית לחלבון שמעניין אותך
משאבת מיקרו-הזרקה	World Precision Instruments, Inc.	PV830	PicoPump פנאומטי ניתן להשתמש במערכות מיקרו-הזרקה רבות ושונות
מיקרו-מניפולטור	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	ימני (MMJL לשמאלי)
מחטי מיקרו-הזרקה, קוטר חיצוני 1.0 מ"מ	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	אלה הם נימי זכוכית בורוסיליקט, שנמשכו לתוך מחט
מחזיק מחטים	World Precision Instruments, Inc.	5430-הכל	ערכת פיית פיקו; הקפד להכניס את אטם פיפטה 1.0 מ"מ
מושך מחטים	סאטר אינסטרומנט ושות'	P-97	גם מושכי מיקרופיפטה/מחטים אחרים אמורים לעבוד
מיקרוסקופ	לייקה, ניקון, Zeiss	המספר משתנה בהתאם ליצרן	כל סטריאומיקרוסקופ עם אופטיקה 20X ויכולת לעבוד עם מיקרומניפולטורים
2-פנוקסיאתנול	סיגמא-אולדריץ'	77861-1L	הרדמה; לדלל 1:1000 במי מערכת דגים לפרוצדורה, 1:500 להמתת חסד