הזדווגות וביציות בימוי: שיטה ליצירת עוברים ומייונם לפי שלב התפתחותי

Abstract

מקור: Hostelley T.L., et al. הכנת דגימה וניתוח נתוני ביטוי גנים מבוססי RNASeq מדגי זברה. J. Vis. Exp. (2017)

המאמר מתאר פרוטוקול ליצירת עוברים של דגי זברה באמצעות הזדווגות טבעית ומיון שלבי ההתפתחות שלהם. הפרוטוקול משמש גם לניתוח תאי β בלבלב באמצעות דגים טרנסגניים.

Protocol

1. יצירת עוברים באמצעות הזדווגות טבעית

1. עוברים בתרבית עד גיל 3 חודשים, בשלות רבייה.
2. הפרידו דגים זכרים ונקבות בוגרים מהזן הרצוי למכלי הזדווגות מחולקים בערב שלפני איסוף העוברים, והוסיפו 2 זכרים ו-3 נקבות לכל מכל מכל
   הערה: השימוש בזן הכתב הפלואורסצנטי transgenic insulin2a:mCherry איפשר ניתוח של תאי β בלבלב.
3. העבירו דגים למיכל ההזדווגות עם מי מערכת מתוקים והסירו את המחיצה מיד לאחר שהאורות נדלקים למחרת בבוקר.
4. אפשרו לדגים להזדווג באופן טבעי עד שהעוברים נצפים במיכל התחתון. יש לאסוף עוברים במרווחים של 30 דקות עד לאיסוף הכמות הרצויה. אחסנו כל נקודת זמן שנאספה בצלחות פטרי נפרדות במדיה עוברית בטמפרטורה של 28.5°C.
5. לבצע מיקרו-הזרקה של חומר גנטי או מיקום במדיה של תרבית ניסויית, אם תרצה, ולתרבית את העוברים בתווך העובר הטרי של האנק בצלחות פטרי של 10 ס"מ בטמפרטורה של 28.5°C.
   הערה: לניתוח ביטוי גנים בבעלי חיים מוזרקים או מוטנטיים במורפולינו (MO), שים לב שלכל מניפולציה עשויות להיות השפעות מקריות על ביטוי גנים. מוטנטים יכולים להציג פיצוי גנטי ברמת שעתוק שאינו נצפה על ידי מיקוד גנים מבוסס MO.

2. שלב העוברים

1. תרבית את העוברים בקבוצות של 50-75 עוברים לכל צלחת פטרי של 10 ס"מ כדי לקדם תזמון התפתחותי עקבי של כל העוברים.
2. עקוב אחר המורפולוגיה ההתפתחותית באמצעות מיקרוסקופ מנתח בשלבי בלסטומר, אפיבולי וסומיט כדי להבטיח התקדמות התפתחותית.
   הערה: הסר עוברים גוססים או פגומים כדי למנוע עיכוב התפתחותי בצלחת.
3. הפרידו את העוברים בהתאם לגיל ההתפתחותי. שלב את העוברים והזחלים באמצעות אורך הגוף הכולל לאחר 24 hpf.
   הערה: הסומיטים הם הרקמה המזודרמלית בצורת שברון הקיימת בחלק הגבי של העובר.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mשרי	ZIRC	ZL1483
מיכלי הזדווגות סט מיכלי מעבר 1.0L	אקוונירינג	ZHCT100
מיקרוסקופ מנתח	זיס