מיצוי DNA מקליפ זנב: שיטה המשמשת בגנוטיפ של דגי זברה

תקציר

מקור: Xing L., et al. גנוטיפ מהיר ויעיל של דגי זברה באמצעות PCR עם ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה. J. Vis. Exp. (2014).

מאמר זה מתאר מיצוי DNA מקליפס זנב של דג זברה. הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה ויעילה לניתוח גנוטיפים של דגי זברה.

פרוטוקול

1. הכנת DNA

1. הכינו מאגר DNA lysis: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. יש להוסיף פרוטאינאז K טרי לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ביום השימוש.
2. אוסף רקמות:
   1. לקליפ סנפיר דג בוגר:
      1. מרדימים דגים: מניחים את הדג בתמיסת 0.004% MS-222 (טריקאין). המתן עד שתנועת הזימים תאט.
      2. מניחים דגים על ערימה של 5-10 מגבונים וחותכים חתיכה קטנה מסנפיר הזנב, בערך 2-3 מ"מ, עם סכין גילוח סטרילי.
      3. הניחו במהירות את הדג במיכל מסומן עם מים מתוקים להתאוששות; תייגו בזהירות הן את המיכל והן את הצינור המתאים שיכיל את תפס הסנפיר. החליפו את המים והאכילו את הדגים אחת ליומיים.
      4. הרימו את אטב הסנפיר עם קצה פיפטה סטרילי והעבירו אותו לצינור מלא במאגר DNA ליזה של 100 μl.
      5. השליכו את קצה הפיפטה, והשליכו את סכין הגילוח למיכל חד.
   2. עבור קליפס זנב עובר:
      1. הכניסו את העוברים לתמיסת 0.004% MS-222 (טריקאין). המתינו 2 דקות.
      2. חותכים חתיכת זנב עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ ניתוח.
      3. הכניסו את הזנב לצינור מסומן מלא במאגר ליזה של 30 μl DNA.
      4. הכניסו במהירות את העובר לצינור המכיל 100 μl 4% paraformaldehyde.
      5. תייגו צינורות עם עוברים וצינורות הזנב המתאימים להם.
      6. אחסנו את הצינורות עם העוברים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לצורך קיבוע.
      7. נקו את המלקחיים באמצעות מי מילי-קיו ומגבוני קימוויפס בין כל עובר כדי למזער את הזיהום.
   3. לעוברים שלמים:
      1. הכניסו את העוברים לתמיסת 0.004% MS-222 (טריקאין). המתינו 2 דקות.
      2. שים 1-5 עוברים בצינור מלא 100 μl DNA lysis buffer. אין צורך בדכוריון.
3. עיכול DNA
   לדגור צינורות עם רקמות (סנפיר או זנב קליפס או עוברים) ב 55 ° C במשך 4 שעות עד לילה.
4. להשבית את Proteinase K
   יש לחמם צינורות ל-95°C למשך 15 דקות. יש להשתמש ב-DNA עבור PCR באופן מיידי, או לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד 3 חודשים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תערובת מאסטר 100 Reaction LightScanner	ביופייר	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
טריקאין
פרפורמאלדהיד