הכנת דגימת מיקרוסקופ גיליון אור: הרכבת עוברים חיים של דגי זברה להדמיה ארוכת טווח

Abstract

מקור: Icha J., et al. שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור כדי לדמות התפתחות עיניים של דגי זברה. J. Vis. Exp. (2016).

מאמר זה מתאר הכנת דגימות למיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור. הוא גם מדגים שיטה להרכיב עוברים חיים של דגי זברה לצורך הדמיה ארוכת טווח, המאפשרת הקלטה של סרטים בהילוך ארוך של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים.

Protocol

1. הכנת דוגמאות

1. הכנת תערובת האגרוז
   1. 15 דקות לפני הכנת תערובת האגרוז, המיסו אליקוט אחד של 1 מ"ל של 1% נקודת התכה נמוכה אגרוז (מומס במדיום E3) בבלוק חימום המוגדר ל-70°C. ברגע שהאגרוז מותך לחלוטין, מעבירים 600 μl לצינור טרי של 1.5 מ"ל, מוסיפים 250 μl של E3 בינוני, 50 μl של 0.4% MS-222 ו- 25 μl של תמיסת מלאי חרוזים מעורבלת.
      הערה: זה עושה 925 μl של התערובת, בעוד 75 μl נוסף מחושב עבור הנוזל הוסיף מאוחר יותר יחד עם העוברים.
   2. שמור את הצינור בבלוק חימום שני ב 38-40 מעלות צלזיוס או לוודא כי האגרוז קרוב מאוד לנקודת הג'ל שלה לפני הכנסת עוברים מדגם לתוכו.
2. הרכבת העוברים
   1. לוקחים חמישה נימי זכוכית בנפח 20 μl (עם סימן שחור, ~ 1 מ"מ קוטר פנימי) ומכניסים לתוכם את בוכנות קצה הטפלון התואמות. דוחפים את הבוכנה דרך הנימים כך שקצה הטפלון נמצא בתחתית הנימים.
   2. להעביר חמישה עוברים (מספר שניתן להרכיב בבת אחת) עם פיפטה זכוכית או פלסטיק לתוך צינור של מערבולת 37 ° C תערובת אגרוז חם.
      הערה: נסו לשאת כמות מינימלית של נוזלים יחד עם העוברים.
   3. הכניסו את הנימים לתערובת ומצצו עובר אחד פנימה על ידי משיכת הבוכנה למעלה. ודא כי ראש העובר נכנס נימים לפני הזנב. הימנעו מבועות אוויר בין הבוכנה לדגימה. צריך להיות ±2 ס"מ של אגרוז מעל העובר ו ±1 ס"מ מתחתיו. חזור על הפעולה עבור העוברים הנותרים.
   4. המתן עד האגרוז מתמצק לחלוטין, מה שקורה תוך מספר דקות ולאחר מכן אחסן את הדגימות במדיום E3, על ידי הדבקתן לקיר של עם פלסטלינה או קלטת. הפתח התחתון של הנימים צריך להיות תלוי חופשי בתמיסה המאפשרת חילופי גז לדגימה.
      הערה: פרוטוקול דומה לסעיפים 1.1 ו-1.2 ניתן למצוא גם בדף הוויקי של OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. מיקום לדוגמה

1. אסיפת מחזיקי מדגם
   1. הכנס 2 שרוולי פלסטיק בגודל הנכון (שחור) זה כנגד זה לתוך גזע מחזיק הדגימה. צידי החריץ שלהם צריכים לפנות החוצה. חבר את בורג המהדק באופן רופף על ידי סיבובו 2-3 סיבובים. הכנס את הנימים דרך בורג המהדק ודחוף אותו דרך המחזיק עד שרצועת הצבע השחורה הופכת גלויה בצד השני. הימנע מלגעת בבוכנה.
   2. הדקו את בורג המהדק. לדחוף את עודף 1 ס"מ של agarose מתחת לעובר מתוך הנימים לחתוך אותו. הכנס את הגבעול לדיסק מחזיק הדגימה.
   3. אשר בתוכנה כי שלב המיקרוסקופ נמצא במצב עומס. השתמש במסילות הנחיה כדי להחליק את כל המחזיק עם הדגימה אנכית כלפי מטה לתוך המיקרוסקופ. סובב אותו, כך שדיסק המחזיק המגנטי יינעל למקומו.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ Lightsheet Z.1	קרל זיס מיקרוסקופיה
נקודת התכה נמוכה agarose	רוט	6351.1
נקודת התכה נמוכה agarose	סיגמא	A4018 או A9414
אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט (MESAB/ MS-222/טריקאין)	סיגמא	E10521
20 μl (קוטר פנימי של 1 מ"מ, מסומן בשחור) נימים	מותג	701904	נמכר כחלק חילוף עבור Transferpettor
בוכנות קצה טפלון עבור 20 μl נימים	מותג	701932	נמכר כחלק חילוף עבור Transferpettor