$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת עוברים
- לאחר ההזדווגות, קצרו עוברים ב-E3 בצלוחית פטרי ודגרו עליהם בטמפרטורה של 26.5°C במשך כ-28 שעות לפני ההרכבה.
הערה: זה מאט את התפתחות העוברים כך שהעוברים נמצאים בערך בשלב של 30 סומיט בתחילת ההדמיה.
- להרדים עוברים ב-0.016-0.020% טריקאין ב-E3. כדי לעכב פיגמנטציה, הוסף PTU לריכוז של 200 מיקרומטר.
- Dechorionate את העוברים באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ נתיחה. בעזרת שתי מלקחיים, אחזו ומשכו בעדינות את הכוריון כדי לשחרר את העובר.
2. הרכבה באגרוז
הערה: שיטת ההרכבה שפותחה דורשת שני ריכוזים שונים של אגרוז בעל המסה נמוכה ב-E3 עם 0.02% טריקאין ו-PTU לפי הצורך. תמיסת האגרוז הראשונה מכילה ריכוז אופטימלי של אגרוז שבו העיוות והתנועתיות הם מינימליים. המיטוב מתואר בשלב 5 להלן.
- מחממים את תמיסות האגרוז עבור שתי השכבות (ריכוז מוגדר בשלב 5 להלן ו-1%) עד 65°C. תנו לאגרוז להתקרר לכ-30 מעלות צלזיוס ממש לפני ההרכבה, כך שהעובר לא ייפגע מהחום. להרכבה, השתמשו בכלים תחתונים מזכוכית בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית כיסוי מס' 0. זכוכית הכיסוי המחוברת לתחתית הכלי יוצרת באר רדודה בקוטר 10 מ"מ (כ-1.2 מ"מ עומק), בה יש להניח את העובר.
הערה: במקרה זה, הריכוז עם התנועתיות והעיוותים הפחותים ביותר היה בין 0.025 ל -0.040% אגרוז.
- מניחים בעדינות עובר דה-כוריוניטי עם אחד הצדדים הצדיים שלו לכיוון תחתית הצלחת באמצעות פיפטה זכוכית או מיקרופיפטה. אם אתם משתמשים במיקרופיפטה, חתכו את החלק החיצוני של הקצה כדי להגדיל את גודל הפתח כך שיתאים לעובר (איור 1A). בזהירות להסיר את E3 שנותר עם micropipette.
- הוסיפו את תמיסת האגרוז הראשונה לבאר הקטנה שנוצרה על-ידי זכוכית הכיסוי המחוברת לתחתית הצלחת כדי לכסות את העובר (שכבה 1) (איור 1B). ודא כי agarose מכסה את הבאר הקטנה אבל לא יעלה על גדותיו.
- כסו את הבאר הקטנה בזכוכית כיסוי (22 מ"מ x 22 מ"מ) (איור 1C) כדי ליצור חלל צר מלא אגרוז עם העובר בין שתי כוסות הכיסוי.
- הניחו שכבה של תמיסת אגרוז 1% על גבי זכוכית הכיסוי על כל תחתית הכלי (שכבה 2) (איור 1D). כאשר שכבה זו מתמצקת, היא מחזיקה את זכוכית הכיסוי במקומה.
- מלאו את החלק הנותר של המנה ב-E3 שמכיל 0.02% טריקאין כדי לשמור על המערכת רוויה בנוזלים (שכבה 3) (איור 1E).
הערה: במערך זה, זכוכית הכיסוי והאגרוז 1% מגנים על השכבה התחתונה מפני דילול.
3. אופטימיזציה של פתרון agarose עבור שכבה 1
- כדי לזהות את הריכוז האופטימלי של אגרוז עבור שכבה 1, השתמש בגישת חיפוש רשת רב-ממדית. הר עוברים בריכוזים הולכים וגדלים של אגרוז הנעים בין 0.01% ל -1% ולאחר מכן הדמיה בהילוך מהיר של הגבלת גדילת העובר ותנועתיות בשדה הראייה. זהה את הריכוזים שבהם הן העיוות והן התנועתיות הם מינימליים.
- כדי לייעל עוד יותר את ריכוז האגרוז, יש להרכיב את העוברים באמצעות טווח עדין יותר של ריכוזי אגרוז (למשל, בין 0.025% ל-0.040% אגרוז) בהתאם לריכוז שנמצא כטוב ביותר בשלב 3.1 (למשל, 0.025%, 0.028%, 0.031% וכו').
הערה: במעבדה שלנו, ריכוז האגרוז האופטימלי היה סביב 0.03%.
