$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הגדרת מיקרוסקופ, רכישת תמונה, עיבוד וניתוח
- מכינים אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 0.8% (LMP): מוסיפים 0.8 גרם אגרוז LMP ל-100 מ"ל E3 ומחממים עד להמסה מלאה. בעודו חם, aliquot 1 מ"ל של LMP agarose לתוך צינורות microfuge 1.5 מ"ל בלוק חימום 37 °C. אגרוז LMP יישאר מותך ב 37 ° C. להוסיף 40 μl של 4 מ"ג / מ"ל (25x), pH 7.0 tricaine לכל 1 מ"ל aliquot של LMP agarose ב 37 ° C. הערה: אם עובדים עם זן פיגמנט, להוסיף 20 μl של 0.15% (50x) PTU לכל 1ml aliquot.
- לאחסן את שארית LMP agarose במשך מספר חודשים בצינורות אטומים 50 מ"ל ב 4 ° C.
- להרדים עוברים פרביוטיים כדי להיות הדמיה על ידי הוספת 1 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל (25x), pH 7.0 tricaine ל 25 מ"ל של E3 כי העוברים כבר נמצאים.
- מערבלים בעדינות את הצלחת כך שהעוברים יצטברו באמצע. לאחר מכן, באמצעות פיפטת העברת פלסטיק רחבה, לצייר את העוברים בתוך נוזל קטן ככל האפשר. סובבו את הפיפטה זקופה והקפיצו בעדינות את העוברים כך שיתמקמו לתחתית הפיפטה.
- עם העוברים בתחתית פיפטה, להעביר אותם 1 מ"ל aliquot של אגרוז LMP על ידי נגיעה קלה את קצה פיפטה על פני השטח של agarose. הימנע העברת נוזלים עודפים כמו זה ידלל את agarose.
- לאחר הוצאת עודפי הנוזל מהפיפטה, השתמשו בפיפטה כדי לערבב בעדינות את העוברים בתוך האגרוז, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה כדי להעביר את כל האגרוז והעוברים לבאר של תחתית זכוכית (מס '1.5 כיסוי), צלחת 6 בארות.
הערה: יש להקפיד להשליך את פיפטה לאחר העברת העוברים לצלחת ההדמיה. שאריות אגרוז ישקעו בתוך הפיפטה, מה שהופך אותה ללא יעילה לשימוש נוסף. במקום זאת, השתמש פיפטה חדשה בכל פעם.
- תחת סטריאוסקופ, השתמש בקצה פיפטה להעמסת ג'ל המקובע בקצה מחט מתגרה עם ידית עץ כדי למקם את העוברים כלפי מטה לכיוון זכוכית הכיסוי (כדי להבטיח שהם נמצאים במרחק העבודה של מטרת המיקרוסקופ) ובכיוון הרצוי להדמיה.
הערה: מקם מחדש ברציפות עד שהאגרוז שוקע במלואו. יש להרכיב את העוברים הפרביוטיים על פיהם יש לצלם את העובר של הזוג. בהתחשב באוריינטציה האקראית של העוברים המחוברים, עבור זוגות מסוימים ייתכן שיהיה קשה לדמיין את שני העוברים. בתרחיש זה, לשחזר את העוברים מן agarose באמצעות מלקחיים פיפטה העברת פלסטיק רחב ולאחר מכן להרכיב מחדש עבור הדמיה מנקודת מבט אחרת.
- לאחר agarose יש להגדיר, לכסות עם 2 - 3 מ"ל של E3 בתוספת tricaine (ו PTU במידת הצורך).
- דמיינו את העוברים באמצעות מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי רחב שדה הפוך, קונפוקלי סורק לייזר או דיסק מסתובב קונפוקלי. בחר את המטרה המתאימה ביותר להדמיה הרצויה. עבור שדה ראייה של עובר שלם, השתמש במטרה 4x. בחר הגדלה גבוהה יותר, כגון מטרה של 20x, כדי ליצור תמונה של רקמה
ספציפית
הערה: אם אתם משתמשים במיקרוסקופ זקוף, יש להרכיב ב-LMP agarose (בדומה למעל) על משטח זכוכית. הפכו את מכסה הזכוכית על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית עם טבעת של שומן ואקום מלא באותו E3-tricaine-PTU.
- עבד תמונות שנרכשו באמצעות חבילות תוכנה חינמיות לניתוח תמונות כגון NIH Image J/FIJI.
הערה: ספור מספרי תאים וכמת דינמיקה כגון נדידת תאים וחלוקת תאים באמצעות אלגוריתמי סגמנטציה ומעקב.