אקסוטומיה של לייזר דו-פוטון: שיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה ולצפות בהתאוששות אקסונלית

תקציר

מקור: O'Brien G. S., et al. אקסוטומיה של שני פוטונים והדמיה קונפוקלית בהילוך מהיר בעוברים חיים של דגי זברה. J. Vis. Exp. (2009).

סרטון זה מתאר את השיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה באמצעות שתי אקסוטומיות לייזר פוטונים וצפייה בהתאוששות אקסונלית מפציעה.

פרוטוקול

1: אקסוטומיה של שני פוטונים באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני שנבנה בהתאמה אישית עם לייזר זיקית Ti-Sapphire

1. התכוננו להדמיה. הניחו את העוברים המורכבים על מחזיק שקופית מתחת למיקרוסקופ. התמקדו בעובר אחד עם יעד מים של 40X (0.8 NA). הפעל את הלייזר. הצלחנו לשחזר ולפגוע בתאי עצב המבטאים GFP באמצעות הפרמטרים הבאים. כדי להמחיש אקסונים בעוצמה שאינה מזיקה, הגדר לייזר לאורך גל של 910 ננומטר (ננומטר) ולהספק של 30 מילי-וואט (mW המפורטים הם כמות ההספק בדגימה). פתח את תוכנת ההדמיה. אנו משתמשים בתוכנת ScanImage שפותחה במעבדה של Karel Svoboda.
2. לחץ על פוקוס כדי לסרוק את העובר עם לייזר שני פוטונים, אתר את האקסון שברצונך לבצע אקסוטומיזציה, וללכוד תמונה של אקסון זה. סמן את המיקום הראשון והאחרון של Z, קבל את התמונה ובצע הקרנה מרבית של ערימות Z.
3. התקרבו פי 70 לענף של האקסון שברצונכם לבצע אקסוטומיה והפסיקו לסרוק. הגדל את mW בדגימה להספק מזיק של 180 mW, ובצע סריקה אחת עם הלייזר. אנו עושים זאת על ידי הגדרת מספר פרוסות Z ל -1 ולחיצה על "תפוס". זה אמור להספיק כדי לנתק את האקסון. ראה דיון לקבלת שיטות למיטוב הליך זה עבור המיקרוסקופ ומטרת הניסוי שלך.
4. הקטן את התצוגה, הפחת את ההספק ל- 30 mW וצלם תמונה.

2: אקסוטומיה של שני פוטונים במיקרוסקופ קונפוקלי/דו-פוטוני Zeiss 510

1. הניחו את העובר המותקן על הבמה והביאו אותו למיקוד באמצעות מטרת מים פי 25 או מטרה מתאימה אחרת.
2. הפעל את שני הלייזרים פוטון (910 ננומטר) וארגון (488 ננומטר) בסביבה מרובת מסלולים, כך שניתן יהיה לעבור מאחד לשני. למרות ששני הלייזרים משמשים לגילוי GFP, פליטת שני פוטונים מומחשת באדום, ופליטת לייזר ארגון בירוק כדי להבדיל בין השניים.
3. השתמש בלייזר ארגון כדי לזהות אקסון לפצוע. תחת הגדרות Z, סמן את המקטעים האופטיים הראשון והאחרון. צלם תמונה קונפוקלית וצור הקרנה מרבית של ערימת Z.
4. בחר את האזור של האקסון להיפגע והבא את האזור הזה למיקוד. כבה את לייזר ארגון והפעל את הלייזר בעל שני הפוטונים. סרוק את הדגימה עם שני הפוטון בעוצמת לייזר של ~9% שידור כדי לוודא שהאקסון עדיין בפוקוס.
5. לחץ על כפתור "עצור" כך שכלי החיתוך יהיה זמין. השתמש בחיתוך כדי להגדיל את תחום העניין. בדרך כלל אנו מתקרבים ל~70X (ניתן לבדוק זום תחת הכרטיסייה "מצב"). תחת הכרטיסייה "ערוצים" לשנות את עוצמת שני פוטונים מ ~ 9% שידור ל 15-20% שידור.
6. כדי לנתק אקסון, הפעל את כפתור "XY מהיר" למשך כשניה אחת ולאחר מכן לחץ על לחצן העצירה כדי למנוע נזק עודף. יש לראות את האקסון כפסולת מפוזרת אם ההליך עבד.
7. כדי לוודא שהאקסון ניזוק, חזור ללייזר ארגון 488 ננומטר, צלם תמונה קונפוקלית נוספת וצור הקרנה מרבית.